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鬼臼毒素衍生物CIP-36抗肿瘤多药耐药作用机制研究

作　者: 张元
导　师: 陈虹
学　校: 河北医科大学
专　业: 药理学
关键词: 鬼臼毒素衍生物细胞凋亡 P糖蛋白拓扑异构酶Ⅱ 细胞周期抗多药耐药
分类号: R965
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的：本文研究新鬼臼毒素衍生物CIP-36对多种多药耐药肿瘤细胞株和动物移植性肿瘤的抑制作用,并初步探讨其作用机制。方法：1 MTT法和SRB法检测CIP-36的体外抗肿瘤活性。MTT法和SRB法测定CIP-36在体外对各种肿瘤细胞KB、KBv200、Hela、SKOV3、BGC-823、MCF-7、LoVo、HOS、SMMC-7721、HepG-2、K562、K562/AO2)及正常细胞(VEC、FB)的IC50或GI50值。2光学和荧光显微镜观察CIP-36作用后肿瘤细胞形态结构的变化。3琼脂糖凝胶电泳分析CIP-36对KBv200细胞染色体DNA断裂的影响。4流式细胞术分析CIP-36对K562/A02细胞周期及凋亡率的影响。5RT-PCR法检测不同浓度CIP-36 (1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L)对K562和(或)K562/A02细胞mdr-1、p53、p21、bcl-2、bax、caspase-3、PCNA、cyclinA、cyclinB1、topoⅡα、topoⅡβ、mRNA表达的影响。6免疫细胞化学法和Western-blot法观察不同浓度CIP-36 (1μmol/L 2μmol/L、4μmol/L)对K562/A02细胞P-gp蛋白表达的影响。7超螺旋pBR322 DNA断裂法检测CIP-36对拓扑异构酶Ⅱα活性的影响8利用动物移植肿瘤模型研究CIP-36体内抗肿瘤作用。结果：1 CIP-36的体外抗肿瘤活性MTT法检测发现CIP-36对多种贴壁肿瘤细胞均有较好的活性,IC50为1.41μmol/L～5.96μmol/L;尤其对人口腔上皮癌细胞株KB效果比较明显,IC50为1.41μmol/L。SRB法对K562和K562/A02的GI50分别为1.02μmol/L和3.34μmol/L。与阳性对照药依托泊苷比较CIP-36在体外显示了更强的抗肿瘤活性,且无耐药性出现。同时对人的正常血管内皮细胞(VEC)、成纤维细胞(FB)具有低毒性,,对肿瘤细胞有较好选择性。通过对K562和K562/A02细胞生长曲线的观察,发现CIP-36对多药耐药肿瘤细胞及其亲本株都具有生长抑制作用,并呈剂量依赖性,同等浓度的CIP-36抑制肿瘤细胞生长活性高于阳性对照依托泊苷(VP-16)。2 CIP-36的体内抗肿瘤作用分别连续腹腔注射CIP-36 (25mg/kg/d、50mg/kg/d) 5d,观察其对小鼠实体型肉瘤S180的生长抑制率分别为55.11%和62.72%,高低剂量组与对照组相比均具有显著性差异(P<0.01),并有一定剂量依赖性。且在小鼠体重降低方面各治疗剂量组(P>0.05)与阳性对照组(依托泊苷)(P<0.05)比,未及依托泊苷组下降明显。说明CIP-36在体内试验表现出良好的肿瘤抑制作用,且无明显毒副作用。3 CIP-36诱导多药耐药肿瘤细胞凋亡CIP-36能够诱导K562/A02细胞凋亡,不同浓度的CIP-36 (1μmol/L 2μmol/L、4μmol/L)作用于K562/A02细胞24h后,用Giemsa染液和荧光染料Hoechst 33342对细胞进行染色,并利用光学和荧光显微镜观察。光学显微镜下观察发现CIP-36可使细胞核染色质发生聚集、碎裂；荧光显微镜下观察发现低浓度CIP-36可使细胞核膜皱缩,染色质凝集,深染,中高浓度组多数细胞形成众多大小不等的凋亡小体,具有一定的量效关系。不同浓度的CIP-36 (1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L)作用于KBv200细胞24h后,提取总DNA进行琼脂糖凝胶电泳,呈现显著“DNA梯子”(DNA ladder)。流式细胞术进行细胞的DNA含量测定,可见不同浓度的CIP-36 (1μmol/L和4μmol/L)作用于K562/A02细胞6h后,即开始出现细胞凋亡,且凋亡细胞的比例随着CIP-36浓度的升高和作用时间的延长而增加。以上结果从形态学、生化学、流式细胞仪三个角度均显示了CIP-36能够诱导多药耐药肿瘤细胞凋亡。4 CIP-36对多药耐药肿瘤细胞(K562/AO2)周期的影响流式细胞仪分析CIP-36对K562/A02细胞周期移行的影响。经不同浓度的CIP-36 (1μmol/L、4μmol/L)分别作用于K562/A02细胞6h、12h、24h后,发现其中6h、12h细胞周期被阻断在S期,而24h细胞周期被阻断在S/G2+M期。5 CIP-36对K562和(或)K562/A02多药耐药性基因mdr-1、topoⅡα、topoⅡβ,凋亡相关基因p53、bcl-2、bax、p21、caspase-3,核增殖相关基因PCNA,细胞周期相关基因cyclinA、cyclinB1 mRNA表达及mdr-1编码的蛋白P-gp表达的影响。不同浓度的CIP-36 (1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L)作用于K562和(或)K562/A02细胞24小时后,RT-PCR结果显示CIP-36可上调K562细胞中p53、p21、bax、caspase-3、topoⅡα、mRNA的表达,下调bcl-2、PCNA mRNA的表达；在K562/A02细胞中可上调p53、p21、bax、caspase-3、topoⅡα及cyclinA mRNA的表达；降低了bcl-2、mdr-1、PCNA和cyclinB1 mRNA的表达,同时发现CIP-36对K562和K562/A02细胞中topoⅡβ的mRNA表达无影响。免疫细胞化学法结果显示不同浓度的CIP-36 (1μmol/L、2μmol/L 4μmol/L)均可使K562/A02细胞P-gp蛋白的表达量降低,且呈一定的剂量依赖性；同时western-blot结果也显示了相同的结果。6 CIP-36对拓扑异构酶Ⅱα活性的影响CIP-36通过稳定酶-DNA-药物复合物的存在,从而抑制TopoⅡα活性,并较同浓度的阳性对照药依托泊苷强,且有一定的剂量依赖性。结论：CIP-36在体外能够抑制多种人源性肿瘤细胞并对多种多药耐药肿瘤细胞株无耐药性,与阳性对照药依托泊苷比较CIP-36在体外显示了更强的抗肿瘤活性。在体内,CIP-36对于小鼠移植性S180肉瘤有较好的抑制作用。CIP-36抗肿瘤作用机制可能与以下途径有关：1、p53途径：上调p21、bax及caspase-3基因表达,同时协同下调mdr-1基因及bcl-2基因的表达；2、上调topoⅡα基因表达,抑制TopoⅡα催化活性；3、下调核增殖相关基因PCNA表达抑制肿瘤细胞增殖；4、下调mdr-1的表达产物P-gp蛋白的表达；5、上调cyclinA,同时协同下调cyclinB1的基因表达阻滞多药耐药肿瘤细胞在S期或G2+M期。因此,CIP-36是一个具有自主知识产权,低毒性的新型抗肿瘤多药耐药化合物,具有良好的开发前景。

全文目录

中文摘要  4-7
英文摘要  7-11
研究论文鬼臼毒素衍生物CIP-36抗肿瘤多药耐药作用机制研究  11-88
  前言  11-12
  材料与方法  12-27
  结果  27-32
  附图  32-64
  附表  64-73
  讨论  73-81
  结论  81-82
  参考文献  82-88
综述  88-97
个人简历  97-98

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