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重组人sCR1功能域SCR15-18的高效制备及其对脑缺血/再灌注损伤的保护作用

作　者: 何莉
导　师: 汪正清
学　校: 第三军医大学
专　业: 微生物学
关键词: 补体 补体1型受体SCR15-18 高密度发酵 蛋白纯化 脑缺血 再灌注损伤 炎症
分类号: Q789
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


缺血性脑血管病的发病率、致残率和病死率都很高,严重危害人类健康。脑缺血/再灌注(cerebra l ischemia and reperfusion,CI/R)损伤一直被认为是影响脑缺血性疾病治疗结果的关键问题。CI/R损伤是多种因素作用的结果,越来越多的研究表明,补体系统在CI/R损伤中起着重要作用,补体被过度激活是造成急性CI/R炎症损伤的主要始动因子之一。活化的补体片段是介导中性粒细胞聚集、活化和内皮细胞损伤等一系列炎症反应的关键因素。因此,补体抑制剂的研究为临床防治CI/R损伤带来新的策略。在经典、旁路、甘露糖结合凝集素(MBL)三条补体激活途径中,虽然活化起始点不同,但都在C3处汇合,形成C3转化酶,由此启动下游一系列介导炎症损伤的介质生成。sCR1的短同源重复序列(short consensus repeats,SCR)15-18段能结合C3b,抑制C3/C5转化酶,可抑制和阻断过量C5a、C5b-9等片段的生成,在始动部位防止CI/R损伤的发生和发展。本文在我室已构建的重组工程菌pET32a-sCR1-SCR15-18/BL21的基础上,使用发酵罐高密度发酵SCR15-18蛋白,优化了其表达条件;用Ni-NTA柱亲和层析方法对蛋白进行了纯化;在谷胱甘肽氧化还原系统中用尿素浓度递减方法对蛋白透析复性;应用补体溶血反应实验观察SCR15-18蛋白在体外抑制补体的活性;用线栓法建立大鼠局灶性大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion ,MCAO)模型,观察SCR15-18蛋白对大鼠CI/R损伤的保护作用。研究的主要内容和获得的主要结果如下:1.将重组工程菌pET32a-sCR1-SCR15-18/BL21复苏,采用摇瓶对培养基、温度、pH值和IPTG浓度等发酵条件进行了摸索,在此基础上采用3.7L发酵罐对IPTG的诱导时机和诱导时间等条件进行优化,筛选出最佳发酵表达条件为:最适培养基为改良M9-CA培养基,最佳培养温度为37℃,IPTG的最佳诱导浓度为0.2mmol/L,最佳诱导时机为生长4h后开始诱导,最佳诱导时间为4h。选择甘油为碳源,在生长期和诱导期分别以40ml/h和70ml/h的速率连续流加补料。全程滴加氨水保持培养基pH值保持在7.5,调节转速控制溶解氧在40%左右。工程菌在以上最佳条件表达时,菌体蛋白产量达到40 g/L以上,SCR15-18蛋白表达率可达到菌体总蛋白的28 %。经SDS-PAGE分析,可见表达蛋白的大小约为43 kD,表达产物经Western blot分析鉴定,在分子量约43 kD处出现单一条带,呈现阳性反应。2.工程菌pET32a-sCR1-SCR15-18/BL21诱导表达后,取发酵菌液超声裂菌, SDS-PAGE分析,表明重组蛋白主要是以包涵体的形式存在。SCR15-18蛋白经Ni-NTA柱纯化后,基本无杂蛋白存在,表明采用亲和层析可实现SCR15-18蛋白的一步纯化。在谷胱甘肽氧化还原体系中(氧化型为0.3 mmol/L,还原型为0.7 mmol/L),用尿素浓度梯度递减的透析方法,获得较好的复性效果。3.体外生物学活性分析显示,重组蛋白能抑制补体的溶血反应,表明我们制备的重组蛋白在体外有抑制补体活性的功能。4.75只雄性SD大鼠,随机分为假手术组、I/R组和SCR15-18保护组。术前1h假手术组和I/R组尾静脉注射PBS,保护组注射SCR15-18蛋白。采用线栓法建立大鼠MCAO模型,缺血2h,再灌注24h后,进行神经功能学评分,测定脑梗死体积、大脑皮质髓过氧化物酶(MPO)活性,观察大脑皮质区补体C3b沉积和病理改变。结果显示,CI/R24h后, SCR15-18保护组神经功能学评分明显低于I/R组(P <0.05),脑梗死体积及脑皮质MPO活性明显低于I/R组(P <0.05); SCR15-18保护组缺血脑组织补体C3b沉积明显减少,病理损伤减轻。表明补体在CI/R损伤中起一定作用, SCR15-18蛋白对大鼠CI/R损伤脑具有保护作用。综上所述:本实验在已经成功构建的重组工程菌pET32a-sCR1-SCR15-18/BL21基础上,对其发酵表达条件进行了优化,获得了较高产量的SCR-15-18蛋白,经过纯化和复性后得到较高纯度的SCR-15-18蛋白,并证实SCR-15-18蛋白在体外具有抑制补体活性;在体内对大鼠急性CI/R损伤有保护作用。为进一步探讨SCR15-18蛋白对缺血/再灌注损伤等疾病的防治研究奠定了基础。

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程） > 基因工程的应用
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