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Genistein对乳腺癌骨转移的防治作用与机理研究

作　者: 张燕燕
导　师: 朱国英
学　校: 复旦大学
专　业: 放射医学
关键词: Genistein 乳腺癌骨转移成骨细胞破骨细胞增殖分化骨结构
分类号: R737.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

研究背景乳腺癌骨转移患者由于转移灶骨组织结构的破坏而出现剧烈骨痛、病理性骨折、高钙血症和神经压迫等症状,严重影响患者生存质量,但其确切机理尚不清楚。目前的研究多集中于探讨乳腺癌细胞致破骨细胞(osteoclast, OC)活性的增加,但单纯抑制OC活性并不能完全阻止溶骨性损伤的进展。近年有研究发现,乳腺癌细胞还可能影响到骨微环境中的其他细胞尤其是成骨细胞(osteoblast,OB)的生物学功能,刺激OB活性也可能是乳腺癌骨转移临床干预的一个重要作用靶点。乳腺癌及其骨转移的临床处理颇为棘手,由于内分泌治疗存在副作用和耐药性,有关选择性雌激素受体调节剂(selective estrogen receptor modulator, SERM)和雌激素天然替代品在乳腺癌辅助治疗及预防骨转移中的应用受到了广泛关注。5,7,4’-三羟基异黄酮(genistein,又称染料木黄酮或金雀异黄酮)是植物雌激素的重要活性成分,能与雌激素受体(estrogen receptor, ER)结合产生雌激素样效应而无其副作用,有抗肿瘤、抗氧化、在正常骨组织代谢中促进骨形成并抑制骨吸收等作用,但在乳腺癌骨转移等病理情况下是否也能调节骨代谢、缓解乳腺癌骨转移所致的骨丢失,尚需深入研究。研究目的采用乳腺癌骨转移裸鼠模型,预防或治疗性给予Genistein进行干预,观察其对裸鼠骨转移灶形成和发展、骨量、骨组织结构、OB和OC生物学功能的影响。同时,采用体外培养成骨细胞,探讨具备不同转移特性的人乳腺癌细胞对成骨细胞生物学功能的影响和作用靶点,以及Genistein对乳腺癌介质中生长的OB生物学功能影响的调控。从动物水平和细胞水平探讨Genistein对乳腺癌骨转移的防治作用及其相关机理,为改变临床单纯抑制OC活性的治疗措施,缓解和预防乳腺癌骨转移时发生的骨丢失提供理论依据和新的干预思路。研究方法采用左心室注射人源性乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞建立乳腺癌骨转移裸鼠模型,预防或治疗性给予Genistein进行干预。实验终点时行裸鼠活体X光显像计数骨转移灶数量并测量肿瘤体积,收集血标本后处死裸鼠,取骨标本行脱钙和不脱钙切片,抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP)染色法观察OC活性,Goldner-Trichrome三色法观察并测量骨量和骨结构变化,自动生化分析仪测量血清钙、磷和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)水平,探讨Genistein对裸鼠骨转移灶的形成和发展,以及乳腺癌骨转移病理条件下对骨量和骨结构、OB和OC活性的影响作用。同时,采用源于大鼠颅盖骨的原代OB进行体外实验,将OB与ER(-)的MDA-MB-231细胞或ER(+)的MCF-7细胞的条件培养基(conditioned medium,CM)共同培养,MTT法观察条件培养基对OB增殖的影响,PNPP法观察条件培养基对OB碱性磷酸酶活性的影响,茜素红S(alizarin red S,ARS)进行矿化结节染色并计算面积观察条件培养基对OB矿化能力的影响,RT-PCR法分析条件培养基对OB骨相关基因BGP、OPG和RANKL表达水平的影响,以分析具备不同转移特性的人乳腺癌细胞对OB生物学功能的可能影响作用和作用靶点。同时,在条件培养基体系中加入不同浓度的Genistein进行干预,进一步从细胞层面探讨Genistein在乳腺癌骨转移的病理条件下,对OB生物学功能的影响及可能作用机制。结果动物实验结果显示：左心室接种了MDA-MB-231乳腺癌细胞后21天,裸鼠经全身X线骨扫描显示多个部位有溶骨性骨转移灶形成,尤其多见于四肢。而预防性(接种乳腺癌细胞前7天或接种同时)给予Genistein进行干预,可不同程度地减少骨转移灶数目和肿瘤体积,并减少TRAP染色阳性的OC数目,并可显著增加骨小梁面积(Tb.Ar%)、骨小梁厚度(Tb.Th)和骨小梁个数(Tb.N),减少骨小梁分离度(Tb.Sp),证明Genistein对乳腺癌骨转移灶的形成和骨转移所致的骨量丢失和骨结构破坏均有较好的预防作用。即使在骨转移灶形成后(接种后21天并经全身X线骨扫描证实)治疗性给予Genistein干预,仍能明显减少骨转移灶数目和肿瘤体积的增加,并减缓骨转移所致的骨量丢失和骨结构损伤。同时,Genistein可部分逆转乳腺癌骨转移时的高ALP血症,并对血钙、血磷代谢失衡有一定修复作用。体外实验结果显示：MDA-MB-231和MCF-7细胞的条件培养基均可使OB发生纤维细胞形态改变,表现为细胞突起和突起连接减少,并可明显抑制OB的增殖：与培养基对照组(vehicle medium, VM)比较,加入50%来自MDA-MB-231或MCF-7细胞的CM后1d、3d、5d和7d,抑制率分别为18.1%、13.0%、19.2%、19.3%和15.8%、20.8%、33.9%、28.7%,且差异均有显著意义(P<0.01)。此外,CM可明显下调OB的ALP活性,并呈剂量-效应关系,尤其是加入50%的CM后,对ALP活性的抑制作用分别达31.9%和47.5%(P<0.01)。CM对OB的矿化结节形成能力也有明显抑制作用,随着加入CM浓度的增加,形成的矿化结节面积明显减少,尤其是加入50%MDA-MB-231或MCF-7的CM培养后,OB形成的矿化结节面积分别减少89%和74%(P<0.01),即OB矿化结节形成能力几乎被完全抑制。同时,乳腺癌细胞条件培养基可明显下调骨相关基因BGP和OPG的表达,上调RANKL基因的表达。而采用5×10-7mol／L、5×10-8mol／L和5×10-9mol／L的Genistein干预后,OB增值率和ALP活性较单纯条件培养基组有不同程度的提高,OB的ALP活性分别较MDA-MB-231和MCF-7条件培养基对照组增加22.7%、32.4%、63.5%和27.7%、32.0%、58.3%(P<0.05)。Genistein还可改善乳腺癌细胞条件培养基对OB矿化能力的抑制,增加OB形成的矿化结节面积,并上调BGP、OPG基因表达,下调RANKL基因表达。结论Genistein可抑制溶骨性骨转移灶的形成和发展,部分逆转乳腺癌骨转移所致的过度骨吸收、骨量丢失和骨结构损伤,对乳腺癌骨转移的预防和治疗均有一定作用。同时,具备不同转移特性的人乳腺癌细胞均可抑制OB的增殖和矿化形成能力,下调ALP活性,即可能通过调节OB功能致骨形成减少。而Genistein可改善乳腺癌细胞对OB生物学功能的抑制作用,即可直接促进OB的增殖、分化和矿化能力,上调骨相关基因BGP和OPG的表达并下调RANKL基因的表达,可能是Genistein在乳腺癌骨转移的病理条件下发挥骨保护作用的机制之一。

Genistein对乳腺癌骨转移的防治作用与机理研究

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