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昆虫肠道芽孢杆菌的绿色荧光蛋白标记及其表达特性研究

作　者: 李强
导　师: 殷幼平
学　校: 重庆大学
专　业: 生物学
关键词: cry3a启动子绿色荧光蛋白短短芽孢杆菌荧光定量PCR gyrB基因
分类号: S476.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

芽孢杆菌是很有应用潜力的蛋白表达宿主菌,可以用于蛋白表达系统的研究,生防细菌的构建等方面。构建带有苏云金芽孢杆菌cry3a基因非芽孢依赖型启动子和绿色荧光蛋白基因gfp(Green Fluorescent Protein)的原核表达载体,并转化从桑粒肩天牛幼虫肠道分离的两株常驻细菌:短短芽孢杆菌CQUBb和苏云金芽孢杆菌CQUBt,以检测cry3a启动子pro3a在昆虫肠道常驻菌中的启动转录活性,获得GFP标记菌株,为常驻菌在昆虫幼虫肠道中的定殖情况研究和杀虫工程菌的构建奠定基础。采用重叠延伸PCR将cry3a基因启动子和gfp基因进行融合,并与大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭载体pHT304连接构建重组质粒pHT3AG,获得的重组质粒以电脉冲转化肠道常驻菌短短芽孢杆菌CQUBb和苏云金芽孢杆菌CQUBt,在可见光和荧光显微镜下观察荧光表型并通过SDS-PAGE分析重组菌株的蛋白表达情况,然后对重组菌株进行生长动力学分析和稳定性测试。该部分研究获得以下主要结果:采用重叠延伸PCR将cry3a基因启动子和gfp基因进行融合,并与pHT304载体连接,成功获得重组质粒pHT3AG。获得的重组质粒以电脉冲并转化进入肠道常驻菌短短芽孢杆菌CQUBb和苏云金芽孢杆菌CQUBt,获得重组工程菌CQUBb-pHT3AG和CQUBt-pHT3AG。工程菌于可见光和荧光显微镜下可观察到明显的绿色荧光。经液体培养,重组菌在营养期大量组成型表达GFP,经电泳分离在凝胶上出现约29 kDa的特异蛋白条带-绿色荧光蛋白,表明cry3a基因核心启动子和gfp基因已成功地转入桑粒肩天牛幼虫肠道常驻菌,并且cry3a基因得核心启动子pro3a可以在非Bt菌株中发挥作用。将重组菌与出发菌株在同样条件下培养,重组菌生长曲线与出发菌没有显著差异,说明外源质粒未对宿主菌的生长带来明显不利影响。两个菌株比较,CQUBb比CQUBt质粒转化率高、重组菌GFP表达时间长、表达量大,并且重组菌株稳定性好,可以用作昆虫肠道内微生态研究和芽孢杆菌表达系统以及杀虫菌株的构建。获得了高效表达外源蛋白的重组菌株CQUBb-pHT3AG后,通过传代培养的方法研究工程菌株的稳定性,研究含有外源蛋白可溶性表达载体的工程菌株CQUBb-pHT3AG的稳定性及菌种保藏时的最佳条件,并以实时荧光定量PCR方法检测工程菌株传代中各代质粒拷贝数的变化。结果显示,在没有筛选压力下工程菌株存在不稳定性,传代至100次时的质粒保有率只有40%;适当的筛选压力(培养时添加抗生素)可以显著降低质粒的遗传不稳定性,100代时重组质粒保有率可以提高到55%。传至各代的工程菌株在菌落形态、菌体形态、生长动力学特性、外源基因序列等方面均未见明显差异。稳定性分析显示重组芽孢杆菌具有一定的遗传不稳定性,这种不稳定包括质粒的完全丢失及部分丢失。适当增加抗性压力可以增加其稳定性。传代40次以内的菌株稳定性较好,可以用作蛋白表达系统建立等方面的研究。实时荧光定量PCR经常被用作质粒或其他基因的拷贝数分析。本研究建立了利用相对实时荧光定量PCR方法对各代的质粒拷贝数进行测定的方法。结果表明,实时荧光PCR是一种快速、方便、低成本的外源质粒稳定性的分析方法。以此种方法分析显示,工程菌传代过程中在没有抗性压力的情况下,随传代次数增加,工程菌株中重组质粒拷贝数有明显的下降趋势;培养时增加抗生素胁迫时这种下降趋势稍缓和。SDS-PAGE分析也显示出随传代次数增加,蛋白表达量有减少趋势,即蛋白表达量同质粒拷贝数具有正相关性。定量PCR过程中为了避免本研究在DNA提取过程中出现较大误差,我们将发酵液超声波破碎后加热处理,并于-20℃储存,将其作为实施荧光定量PCR的模板。在实施荧光定量PCR中,我们考虑了因为染色体DNA的扩增和质粒DNA的扩增效率不同对实验结果的影响。我们在同一次的反应过程中,分别确定两者的扩增效率,分别计算,克服了假设去扩增效率一直带来的误差。这种快速检测方法,我们用之来检测重组芽孢杆菌的质粒拷贝数,分析了在有抗性压力和没有抗性压力的情况下,发酵时或传代时外源质粒的拷贝数变化。经检测,随着传代次数的增加,质粒的拷贝数呈现急剧的减少,在有选择压力的情况下,质粒的稳定性要好于没有选择压力时的稳定性。在我们的研究中,应用个整细胞作为模板,并且考虑待测基因和内参基因的扩增效率差异大大的提升了次方法对工程菌株质粒拷贝数的检测准确性。研究还探讨了工程菌株的贮存条件和耐储性。液体保藏菌株时在保藏条件为20%或30%的甘油水溶液中,经-40℃贮存12个月后仍具有良好的复苏性能(高于50%)。稳定性分析显示重组芽孢杆菌具有一定的遗传不稳定性,这种不稳定包括质粒的完全丢失及部分丢失。适当增加抗性压力可以增加其稳定性。传代40次以内的菌株稳定性较好,可以用作蛋白表达系统建立等方面的研究。

全文目录

中文摘要  3-5
英文摘要  5-11
1 绪论  11-22
  1.1 立题依据  11-12
  1.2 国内外研究进展  12-18
    1.2.1 杀虫细菌的研究进展  12-13
    1.2.2 绿色荧光蛋白对芽孢杆菌标记及定殖研究  13-16
    1.2.3 短短芽孢杆菌的开发与利用  16
    1.2.4 工程菌株稳定性研究  16-17
    1.2.5 相对荧光PCR 检测基因拷贝数的研究  17-18
  1.3 研究目的  18
  1.4 研究内容和技术路线  18-21
    1.4.1 研究内容  18-19
    1.4.2 技术路线  19-21
  1.5 本研究的创新点  21-22
2 GFP 表达载体的构建及其在昆虫肠道常驻菌中的表达  22-41
  2.1 引言  22
  2.2 材料与仪器  22-26
    2.2.1 质粒、菌种和引物  22-24
    2.2.2 培养基  24
    2.2.3 构建重组菌株所用的主要试剂（盒）  24
    2.2.4 转化菌株筛选和伴孢晶体蛋白观察、提取所用试剂  24-25
    2.2.5 蛋白质变性聚丙烯酰胺凝胶电泳所用试剂  25
    2.2.6 主要仪器和软件  25-26
  2.3 方法  26-35
    2.3.1 质粒构建思路及实验方案  26-27
    2.3.2 pro3a-gfp 表达盒的构建  27-32
    2.3.3 重组质粒pHT3AG 的构建  32-33
    2.3.4 重组质粒转化肠道菌 CQUBb 和 CQUBt  33-34
    2.3.5 工程菌株的荧光表型观察  34
    2.3.6 SDS-PAGE 分析  34-35
    2.3.7 工程菌株的生长动力学测定  35
  2.4 结果和分析  35-40
    2.4.1 pro3a-gfp 表达盒的构建  35-36
    2.4.2 重组质粒pHT3AG 的构建与鉴定  36
    2.4.3 肠道菌的转化条件与转化子验证  36-37
    2.4.4 工程菌株在可见光下的荧光表型  37-38
    2.4.5 工程菌株在荧光显微镜下的荧光表型  38-39
    2.4.6 工程菌株表达蛋白的SDS-PAGE 分析  39
    2.4.7 工程菌株生长动力学  39-40
  2.5 本章小结  40-41
3 工程菌 CQUBB-PHT3AG 的遗传稳定性分析  41-46
  3.1 引言  41
  3.2 材料与仪器  41-42
    3.2.1 主要试剂（盒）  41
    3.2.2 仪器和软件  41
    3.2.3 菌株、质粒和培养基  41-42
  3.3 方法  42-43
    3.3.1 传代方法和稳定性计算  42
    3.3.2 形态观察和生长动力学测试  42
    3.3.3 外源质粒的结构稳定性分析  42
    3.3.4 表达蛋白的电泳分析  42
    3.3.5 低温甘油保藏菌株的稳定性测定  42-43
  3.4 结果与分析  43-45
    3.4.1 菌株稳定性  43
    3.4.2 菌落形态与生长状态  43-44
    3.4.3 质粒序列稳定性  44
    3.4.4 传代培养过程中表达蛋白SDS-PAGE 鉴定  44
    3.4.5 低温甘油悬液保藏菌株时的稳定性  44-45
  3.5 本章小结  45-46
4 实时荧光定量 PCR 检测工程菌株外源质粒拷贝数  46-57
  4.1 材料和仪器  46
    4.1.1 菌株、质粒和培养基  46
    4.1.2 主要试剂（盒）  46
    4.1.3 仪器和软件  46
  4.2 方法  46-51
    4.2.1 实验室发酵和传代培养  46-47
    4.2.2 定量 PCR 样品制备  47
    4.2.3 内参基因gyrB 的克隆与测序  47-48
    4.2.4 荧光定量 PCR 引物的设计  48-49
    4.2.5 定量PCR 产物的测序和比对分析  49
    4.2.6 质粒拷贝数的计算和统计分析  49-50
    4.2.7 SYBR GreenⅠ定量 PCR 反应条件  50
    4.2.8 定量PCR 方法的评价  50-51
    4.2.9 应用定量 PCR 监测发酵过程和传代培养过程中的外源质粒拷贝数变化  51
  4.3 结果与分析  51-55
    4.3.1 内参基因克隆，引物特异性分析  51
    4.3.2 定量PCR 的特异性分析  51-52
    4.3.3 实时荧光定量 PCR 的标准曲线构建  52-53
    4.3.4 荧光阈值的选择对质粒拷贝数检测的影响  53
    4.3.5 定量PCR 的重复性分析  53-54
    4.3.6 工程菌株CQUBb-pHT3AG 在传代培养过程中的质粒拷贝数变化  54
    4.3.7 质粒拷贝数同蛋白表达的关系  54-55
    4.3.8 工程菌株CQUBb-pHT3AG 在持续发酵培养过程中的质粒拷贝数变化  55
  4.4 本章小结  55-57
5 讨论  57-60
  5.1 绿色荧光蛋白原核表达载体的构建  57
   5.2 GFP 在昆虫肠道常驻菌 CQUBb 和 CQUBt 中的表达  57-58
  5.3 蛋白表达载体在芽孢杆菌工程菌的遗传稳定性  58-59
  5.4 实时荧光定量 PCR 快速检测质粒拷贝数  59-60
6 结论与展望  60-62
  6.1 主要结论  60-61
    6.1.1 工程菌株构建  60
    6.1.2 重组质粒转化芽孢杆菌  60
    6.1.3 GFP 在两工程菌中的表达  60
    6.1.4 工程菌株生长动力学分析  60
    6.1.5 工程菌株稳定性分析  60-61
    6.1.6 液体冷冻保藏工程菌株  61
    6.1.7 工程菌株质粒拷贝数和蛋白表达的相关性  61
  6.2 后续研究工作的展望  61-62
    6.2.1 基因工程农药开发  61
    6.2.2 工程菌株在昆虫肠道内定殖的研究  61
    6.2.3 表达系统用于工业生产  61-62
致谢  62-63
参考文献  63-68
附录  68
  A. 作者在攻读硕士学位期间发表的论文  68
  B. 作者在攻读硕士学位期间参加的科研项目及得奖情况  68

昆虫肠道芽孢杆菌的绿色荧光蛋白标记及其表达特性研究

内容摘要

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