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巴氏杜氏藻psy侧翼调控序列的克隆及其环境因子调控元件分析

作　者: 唐春晖
导　师: 姜建国；黄明
学　校: 华南理工大学
专　业: 生物工程
关键词: 巴氏杜氏藻 八氢番茄红素合成酶 侧翼调控序列 调控元件 生物信息学分析 增强型绿色荧光蛋白 外源表达盒
分类号: S917.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)是一种原生质体裸露的嗜盐性浮游单细胞真核生物,可在胁迫条件下大量积累β胡萝卜素,已广泛用于商业化生产、类胡萝卜素代谢途径及转基因宿主研究。巴氏杜氏藻培养条件简单,遗传操作有效,用其作为转基因研究的宿主,将具有重要的应用价值。目前,只有少数几个类胡萝卜素代谢途径相关酶基因被克隆并用于β-胡萝卜素代谢调控机制研究。在转基因杜氏藻研究中,合适的启动子与终止子是决定外源基因能否表达和控制表达量的关键元件。目前,利用报告基因gus,gfp等在杜氏藻中的瞬时表达已经初步鉴定了一些外源组成型启动子及终止子,然而,外源性启动子及终止子等调控序列表达效率低下,且多呈瞬时表达,因此,克隆内源性启动子与终止子,推动外源基因在杜氏藻中稳定、高效表达具有重要研究意义和实用价值。研究表明八氢番茄红素合成酶(PSY)是巴氏杜氏藻(简称巴氏藻)类胡萝卜素代谢的途径中的第一个关键调节酶。本实验首先从总RNA中获得并验证巴氏杜氏藻psy(Dbpsy)cDNA序列,采用基于LA-PCR的基因组步移法分别设计两组基因特异引物pSP1-3及tSP1-3,克隆Dbpsy的启动子和终止子序列,利用在线启动子分析软件分析其保守调控序列,并用生物信息学的方法分析了Dbpsy的基因组序列和蛋白质结构。结果表明,Dbpsy启动子除了具有典型的TATA框、CCAAT框和GATA框外,还具有三个保守调控序列:BOXLCOREDCPAL、GT1CONSENSUS和GT1GMSCAM4。BOXLCOREDCPAL受紫外光诱导参与DcMYB1介导的DcPAL1上调作用,促进下游基因的表达;GT1CONSENSUS具有介导TFIIA和GT-1-like因子相互作用的功能,实现光诱导促进β-胡萝卜素的积累;GT1GMSCAM4受强光调控,促进下游基因的表达。蛋白质序列分析表明,PSY的C端相对保守,存在可能的底物结合位点,100aa至400aa为催化活性区域;N端在物种间变异较大,推测PSY调控机制间的细微差异主要由N端变异引起。

全文目录


摘要  5-6
ABSTRACT  6-11
第一章 绪论  11-24
  1.1 类胡萝卜素  11-15
    1.1.1 类胡萝卜素的分布、结构、功能  11-13
    1.1.2 类胡萝卜素代谢途径  13-15
    1.1.3 类胡萝卜素相关遗传工程的研究现状  15
  1.2 盐藻类胡萝卜素代谢途径研究现状  15-19
    1.2.1 盐藻是重要的经济藻类  15-17
    1.2.2 盐藻类胡萝卜素代谢途径  17-19
    1.2.3 盐藻基因工程研究进展  19
  1.3 基因调控序列研究进展  19-22
    1.3.1 启动子结构  19-20
    1.3.2 启动子分类  20
    1.3.3 克隆启动子的方法  20-22
  1.4 本实验研究背景、意义及研究内容  22-24
    1.4.1 研究背景及意义  22
    1.4.2 研究内容  22-24
第二章 实验材料与方法  24-44
  2.1 实验材料  24-28
    2.1.1 藻种及培养液  24-25
    2.1.2 质粒和菌种  25
    2.1.3 试剂及试剂盒  25
    2.1.4 主要仪器设备  25-26
    2.1.5 常用试剂的配制  26-28
  2.2 实验方法  28-44
    2.2.1 杜氏盐藻的培养  28
    2.2.2 提取RNA  28-30
    2.2.3 RT-PCR  30-32
    2.2.4 提取基因组  32-33
    2.2.5 质粒提取  33-34
    2.2.6 Dbpsy 模板序列的验证  34-37
    2.2.7 Dbpsy 启动子序列的克隆  37-42
    2.2.8 Dbpsy 终止子序列的克隆  42-43
    2.2.9 启动子活性验证  43
    2.2.10 生物信息学分析及系统发育树构建  43-44
第三章 实验结果  44-54
  3.1 Dbpsy cDNA 序列和基因组序列  44-46
  3.2 Dbpsy 启动子和终止子  46-52
  3.3 Propsy-EGFP-Terpsy 外源表达盒  52-54
第四章 生物信息学分析  54-63
  4.1 Dbpsy 启动子和终止子的生物信息学分析  54-55
  4.2 Dbpsy 基因组序列的分析  55-58
  4.3 DbPSY 理化性质  58
  4.4 DbPSY 保守结构域和保守基序  58
  4.5 DbPSY 高级结构  58-60
  4.6 DbPSY 同源性及系统发育树分析  60-63
结论与展望  63-66
  结论  63-64
  展望  64-65
  创新点  65-66
参考文献  66-72
攻读硕士学位期间取得的研究成果  72-73
致谢  73-74
附表  74

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产基础科学 > 水产生物学 > 水产植物学
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