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色谱与电色谱纯化头孢菌素C及蛋白质的研究

作　者: 赵明珠
导　师: 赵凤生
学　校: 上海交通大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 色谱电色谱头孢菌素C 蛋白质纯化
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

色谱是分离纯化化学物质和生物物质的常用技术。电色谱,又称电层析,是电泳与色谱相结合的分离技术,即在色谱分离过程中引入电场以提高色谱的分离性能,是近年来国内外液相色谱技术的一个重要发展方向。本文将色谱技术与轴向电场耦合,研究了此种电色谱在生物物质(包括小分子头孢菌素C和大分子蛋白)分离方面的作用,并与色谱技术的分离效果作了比较。本文的实验内容,包括分离纯化头孢菌素C钠盐,从鸡卵清中分离溶菌酶,以及分离牛血清白蛋白、牛血红蛋白、牛胰核糖核酸酶和溶菌酶4种蛋白的混合物;用HPLC检测头孢菌素C,用Bradford法测定蛋白含量,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白的分离效果。首先考察了在HPLC测定头孢菌素C的过程中,样品中有机溶剂含量的影响,发现乙醇等有机溶剂对测定有干扰,但可以通过用水稀释样品以减少这种干扰。用HP-20大孔吸附树脂为固定相,探索了在通电和不通电情况下分离头孢菌素C的效果。结果发现,色谱分离能够使头孢菌素C钠盐水溶液的纯度从87.3%提高到93.5%,提取收率87.0%;电色谱可以将纯度从89.0%提高到93.3%,提取收率94.5%,收率比色谱有所提高。电色谱法在分离亲水性小分子头孢菌素C方面展示了良好的分离效果。在蛋白分离方面,采用CM-52羧甲基纤维素为固定相,研究了从天然鸡卵清中分离溶菌酶,结果发现用聚焦电色谱法和普通离子交换色谱法从天然鸡卵清中分离溶菌酶都是可行的,且分离效果接近,然而聚焦电色谱法所需时间缩短了近一半,提高了分离效率。分离4种蛋白的混合物(牛血清白蛋白、牛血红蛋白、牛胰核糖核酸酶和溶菌酶),结果通电和不通电两种情况在各自的最适pH组合下的分离效果接近,但通电时牛血清白蛋白和溶菌酶的回收率明显提高。综上所述,电色谱法在生物物质的分离方面有着良好的效果,特别是在产品回收率以及分离时间方面优势突出,表明了电色谱技术潜在的应用价值。同时也应看到,色谱与电泳技术的整合是一个复杂的过程,还需要更多的实验研究。

全文目录

摘要  2-4
ABSTRACT  4-8
1 文献综述  8-24
  1.1 生物工程下游技术  8-10
  1.2 电色谱技术  10-16
    1.2.1 电色谱的概念  10
    1.2.2 电色谱的分类  10-12
      1.2.2.1 分析型电色谱技术  10-11
      1.2.2.2 施加电场的高压液相系统  11
      1.2.2.3 低压制备型电色谱技术  11-12
    1.2.3 制备型电色谱装置的设计与改进  12-14
    1.2.4 色谱介质和电场方向的选择  14-16
    1.2.5 制备型电色谱的局限性  16
  1.3 蛋白质的分离纯化  16-20
    1.3.1 蛋白质的聚焦色谱  16-18
    1.3.2 蛋白质的等电聚焦  18-20
  1.4 头孢菌素 C 的提取纯化  20-23
    1.4.1 经典的头孢菌素 C 提取方法  20-21
    1.4.2 新型的头孢菌素 C 提取方法  21-23
  1.5 本课题研究的目的和意义  23-24
2 实验仪器、材料与方法  24-37
  2.1 主要实验仪器  24-25
  2.2 主要试剂与材料  25-27
  2.3 实验方法  27-37
    2.3.1 高效液相色谱分析头孢菌素 C 的条件  27
    2.3.2 头孢菌素 C 发酵液的预处理  27
    2.3.3 HPLC 测定头孢菌素C 的加样回收率  27-28
    2.3.4 色谱法和电色谱法纯化头孢菌素 C  28-30
    2.3.5 分离蛋白所用缓冲液的配制  30-31
    2.3.6 鸡卵清的预处理  31-32
    2.3.7 蛋白混合液的制备  32
    2.3.8 色谱法和电色谱法分离蛋白质  32
    2.3.9 蛋白质含量测定及回收率计算  32-33
    2.3.10 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳  33-37
3 实验结果与讨论  37-64
  3.1 有机溶剂对 HPLC 测定头孢菌素 C 含量的影响  37-42
    3.1.1 各种有机溶剂对HPLC 测定头孢菌素C 含量的影响  37-39
    3.1.2 乙醇浓度对HPLC峰面积的影响  39
    3.1.3 稀释法校正乙醇对头孢菌素 C 含量测定的影响  39-41
    3.1.4 稀释后样品的精密度实验  41
    3.1.5 稀释法的重复性实验  41-42
    3.1.6 稀释法的加样回收率实验  42
  3.2 头孢菌素 C 的分离纯化  42-52
  3.3 鸡卵清蛋白中溶菌酶的分离  52-57
  3.4 牛血清白蛋白、牛血红蛋白、牛胰核糖核酸酶和溶菌酶的分离  57-64
4 结论与展望  64-67
  4.1 结论  64-65
  4.2 展望  65-67
参考文献  67-75
致谢  75-77
攻读学位期间发表的学术论文  77-79

色谱与电色谱纯化头孢菌素C及蛋白质的研究

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