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rBTI对肿瘤细胞株HepG2和EC9706的凋亡及其凋亡相关基因的影响

作　者: 李芳
导　师: 王转花
学　校: 山西大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 荞麦胰蛋白酶抑制剂 凋亡 HepG2 EC9706 Bcl-2 Caspases
分类号: R730.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 21次
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内容摘要


细胞凋亡(Apoptosis)是由于细胞内外环境变化或死亡信号触发以及在基因调控下所引起细胞主动死亡的过程,这一过程对于消除机体内老化细胞或具有潜在性异常生长的细胞、保持机体处于稳定状态起着重要的作用。凋亡有两条主要途径:线粒体启动的内在途径和死亡受体激发的外在途径。前者,促凋亡信号激发细胞色素c自线粒体内膜空间向细胞质释放,形成一个称做apoptosome的由Apaf-1和dATP组成的复合物,同时也活化了半胱氨酸蛋白酶-9(caspase-9);caspase-9的活化激活刽子手caspases,比如caspase-3、caspase-6和caspase-7,这样便触发了一系列凋亡事件,最终导致细胞死亡。后者,开始于一个死亡受体,比如Fas。各种肿瘤病的发生率逐年增高而抗肿瘤药物的数量却相对较少,为了寻找新型而有效的抗肿瘤药物,许多研究者进行了大量实验,并发现生物体内的蛋白酶抑制剂具有潜在的抗肿瘤作用,一种或多种蛋白酶及蛋白酶抑制剂可能在细胞凋亡发生、发展过程中起关键性作用。蛋白酶抑制剂是最早发现的抗肿瘤抑制剂,上世纪九十年代曾有报道,大豆的Bowman-Birk型蛋白酶抑制剂对动物结肠癌有100%抑制作用。蛋白酶抑制剂在抗肿瘤细胞生长方面的作用越来越被人们所认识。许多不同的蛋白酶抑制剂已被证明可以阻止体外细胞恶性转化。有研究提出蓼科植物荞麦种子中的胰蛋白酶抑制剂似有诱导血液病细胞凋亡的作用。但有关该胰蛋白酶抑制剂诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制及新型蛋白类抗肿瘤药物的研究尚处于起步阶段。重组蛋白酶抑制剂抗肿瘤药物的研究也非常有限。我们先前的研究表明基因重组荞麦胰蛋白酶抑制剂(rBTI)具有诱导不同肿瘤细胞凋亡的作用。为了揭示其诱导肿瘤细胞凋亡的可能机理,从基因水平上探讨与凋亡有关的分子事件,本研究用不同浓度的rBTI体外作用于人肝癌细胞HepG2和人食管癌细胞EC9706后,采用MTT比色法检测抑制剂对肿瘤细胞的抑制率,用DNA凝胶电泳和细胞核的形态学观察检测肿瘤细胞的凋亡。结果表明:rBTI在体外能够明显抑制肿瘤细胞的增长,并诱导细胞凋亡。另外,细胞凋亡与Bcl-2/BaxmRNA水平有关。通过RT-PCR检测发现:细胞经过rBTI处理后,抗凋亡基因Bcl-2mRNA水平上调,促凋亡基因Bax mRNA有所下调,而对照GAPDH无变化。对HepG2和EC9706细胞中Fas/Fas配体及半胱氨酸天冬酶(caspases)的研究证明,细胞经过rBTI处理后,对死亡受体Fas mRNA没有影响;rBTI可明显激活caspase-3和-9的酶活性,对caspase-8的活性几乎无影响。上述结果表明,rBTI对HepG2和EC9706细胞具有明显的诱导凋亡作用,其诱导细胞凋亡的机制与caspase-3依赖性凋亡调节信号通路有关,未涉及Fas/Fas配体途径。

全文目录


中文摘要  8-10
Abstract  10-12
第一章 文献综述  12-22
  1 胰蛋白酶抑制剂概述  12-13
    1.1 胰蛋白酶抑制剂的分类  12
    1.2 胰蛋白酶抑制剂在抗肿瘤方面的研究进展  12-13
  2 细胞凋亡的研究  13-17
    2.1 细胞凋亡的定义、特征及检测技术  13-14
    2.2 细胞凋亡的几种主要相关基因和蛋白及其与肿瘤的关系  14-15
    2.3 细胞凋亡的机理和途径  15-17
  3 荞麦胰蛋白酶抑制剂的研究进展  17-18
    3.1 荞麦胰蛋白酶抑制剂的特性研究  17-18
    3.2 荞麦胰蛋白酶抑制剂的功能研究  18
    3.3 本项目研究的意义  18
  参考文献  18-22
第二章 rBTI诱导人肝癌细胞株HepG2的凋亡作用  22-33
  1 材料  22-23
    1.1 细胞  22
    1.2 主要试剂  22-23
    1.3 实验仪器  23
  2 方法  23-25
    2.1 细胞培养  23
    2.2 rBTI抑制HepG2细胞生长的MTT检测  23-24
    2.3 DNA的提取及凝胶电泳检测  24
    2.4 HepG2细胞核的形态学观察  24
    2.5 RNA提取和反转录PCR  24-25
    2.6 Caspases活性的检测  25
  3 结果  25-29
    3.1 rBTI对HepG2细胞生长的MTT检测  25
    3.2 DNA梯状条带的凝胶电泳检测  25-27
    3.3 HepG2细胞核的形态学观察  27
    3.4 rBTI处理对HepG2细胞中细胞凋亡相关基因的影响  27-28
    3.5 rBTI处理后Caspases活性的检测  28-29
  4 讨论  29-30
  参考文献  30-33
第三章 rBTI诱导食管癌细胞株EC9706的凋亡作用  33-42
  1 材料  33
    1.1 细胞  33
    1.2 主要试剂  33
    1.3 实验仪器  33
  2 方法  33-34
    2.1 细胞培养  33
    2.2 细胞计数与存活测试  33
    2.3 rBTI抑制EC9706细胞生长的MTT检测  33
    2.4 DNA的提取及凝胶电泳检测  33-34
    2.5 RNA提取和反转录PCR  34
    2.6 Caspases活性的检测  34
    2.7 细胞周期的检测  34
  3 实验结果  34-40
    3.1 rBTI对EC9706细胞生长的MTT检测  34-35
    3.2 DNA梯状条带的凝胶电泳检测  35
    3.3 rBTI处理对EC9706细胞中细胞凋亡相关基因的影响  35-37
    3.4 rBTI处理后Caspases活性的检测  37
    3.5 细胞周期分析  37-40
  4 讨论  40
  参考文献  40-42
小结与展望  42-44
  1 小结  42
  2 展望  42-44
个人简历  44
在读硕士期间发表论文及参加学术交流情况  44-45
附录  45-46
致谢  46-47

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 一般性问题 > 肿瘤病理学、病因学
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