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（一）抗猪鼻支原体单克隆抗体的研制及双抗体夹心ELISA检测法的建立 （二）念珠状链杆菌血清学抗原检测方法的建立

作　者: 刘星
导　师: 李红；刘云波；魏强
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 动物学
关键词: 猪鼻支原体 单克隆抗体 检测方法 念珠状链杆菌 血清学诊断
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


猪鼻支原体（Mycoplasma hyorhinis）是猪鼻腔的常在菌,除了在自然条件下可引起猪的肺炎,近年来被发现其与人胃癌、大肠癌有高度相关性,已经被认为是一种新发人传染病的病原。由于缺乏简单、快速的检测方法,该病原在人群中的感染情况尚不清楚。因此,该病原检测方法的研究将是流行病学研究的关键。血清学检测方法以其灵敏度高、简便快捷及费用相对低廉等各种优点已经广泛用于病原微生物感染的实验室诊断,尤其是直接血清学方法对于因带菌量少、血清抗体滴度较低的感染检测具有较大的优势。因此,本研究从单克隆抗体研制着手,进而建立以检测抗原为目的的双抗体夹心酶联免疫吸附测定试验法（ELISA）,以期发展一种特异、敏感和快速的人猪鼻支原体感染的检测方法。为此,我们从以下几个方面进行了研究。首先,单抗的制备与鉴定。使用猪鼻支原体CVCC361（购自中国兽药监察所）株全菌抗原免疫BALB/c小鼠,经细胞融合,用ELISA法筛选获得ZB1～ZB17共17个阳性杂交瘤细胞株,其分泌抗体的效价最高达1∶1.28×105以上,并与实验动物常见的7种病原菌及11种支原体呈阴性反应;IgG亚类分别为IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3;免疫印迹试验显示,ZB1、ZB2及ZB16与相对分子质量为35×103的抗原有特异性结合,而ZB3和ZB10与相对分子质量为70×103的抗原有特异性结合。其次,我们建立了以单抗为诊断抗体的双抗体夹心ELISA法。采用最佳配对实验,筛选出以单抗ZB1作为包被抗体、ZB1、ZB2-辣根过氧化物酶标记（ZB1-HRP、ZB2-HRP）作为检测抗体的配对,对猪鼻支原体抗原的检测限均可达到ng级水平,可检出最小抗原量为3.9ng/mL,检出猪鼻支原体活菌8.34×102CFU/mL,与人呼吸道常见的致病微生物及11种支原体均无非特异性反应。综上所述,本研究采用B淋巴细胞杂交瘤细胞技术成功地制备出了17株较高特异性和敏感性的抗猪鼻支原体单克隆抗体,并以其为诊断抗体建立起以检测抗原为目的的双抗体夹心ELISA法,显示了较好的特异性和敏感性。为人群猪鼻支原体流行病学研究提供了一种更可靠而便利的手段,并将对这一新发感染性疾病的研究,进而对人类肿瘤防控有重要的意义。念珠状链杆菌是一种革兰阴性,多形态细菌,可引起人鼠咬热及哈佛山热,其正常宿主为啮齿类动物,对人类、实验小鼠、非人灵长类等有极强的致病性,已经被认为是动物试验工作者的职业危害、是各国实验动物必需排除的致病菌,也被世界卫生组织列为人类新发传染病的病原菌。该病原菌细胞的形态和排列因环境条件及菌龄不同而差别极大,具有自动形成和保持L型的能力,对链霉素、青霉素、四环素较敏感。体外培养营养要求高,生长缓慢。由于念珠状链杆菌特殊的生物学特性,决定了其在实验动物质量常规检测和人感染的实验室诊断的困难性。病原学方法可能因该菌的变异性、特殊营养要求、生长缓慢、带菌量少、形态变异等特性而呈阴性结果;分子生物学方法对该菌的检测尚处于探索阶段,在用于实验动物常规检测时,没有商品化的检测试剂盒,难以确保检测质量,此外,检测成本也是限制该方法的一个重要因素;由于该菌在人和实验小鼠感染后潜伏期短,发病急,间接血清学检测方法也不适用。因此发展以检测病原为目的的直接血清学方法具有十分重要的意义。本研究利用单克隆抗体技术,制备抗念珠状链杆菌的特异性单抗,进而建立双抗体夹心ELISA法,以期建立一种快速、高特异性、高敏感性和低成本的实验动物质量常规检测方法和人类念珠状链杆菌感染的实验室诊断方法,并为进一步的病原学、流行病学研究提供技术储备。为此,我们从以下几个方面进行了研究。首先,对念珠状链杆菌的变异性进行了观察,以确定免疫原。对不同培养条件及培养时间的念珠状链杆菌进行了动态观察,发现不同培养时间及液体培养环境与固体培养基上菌体形态有明显差异,电镜结果显示了细胞结构的变化,链状形态的细菌有细胞壁缺失及膜成分的增厚。结果表明,48h液体培养物既有较典型的原型结构也有变异型,适宜作为免疫原免疫动物。其次,单抗的制备与鉴定。选用48h液体培养物对BALB/c小鼠进行免疫,ELISA法筛选获得SM1～SM16共16个阳性杂交瘤细胞株,其分泌抗体的效价最高达1∶1×105;IgG亚类分别为IgG1、IgG2a;免疫印迹试验显示,SM6、SM7和SM8与念珠状链杆菌在50×103相对分子质量处有反应条带,SM9在35×103相对分子质量处有反应条带。与不同形态的培养物的免疫印迹试验显示,SM9与肉汤及平皿培养物在35×103相对分子质量处均有一条反应条带,SM6、SM7和SM8仅与平皿培养物在50×103相对分子质量处有反应条带;免疫荧光结果显示,SM9与杆状菌体反应较链状菌体强烈,SM6、SM7和SM8则相反;同时,免疫电镜结果显示SM9主要与细胞壁发生反应,而SM6、SM7和SM8的反应主要发生在细胞膜上。进而,我们建立了双抗体夹心ELISA法。最佳配对实验筛选出SM9—SM6-HRP的最佳配对,检测限为125ng/mL,活菌检测限为12.1×102CFU/mL。与人呼吸道常见的致病微生物及支原体均无非特异性反应。可有效的检测L型变异菌,检测灵敏度与非变异菌无显著差别。综上所述,本研究采用B淋巴细胞杂交瘤细胞技术成功地制备出了16株抗念珠状链杆菌单克隆抗体,通过ELISA法、免疫印染法和免疫电镜方法确定了其特异性、敏感性、所结合抗原的相对分子质量,以及和菌体细胞的免疫结合点,以此为基础建立了较高特异性和敏感性的双抗体夹心ELISA法,并能有效地检出L型变异菌。本研究为我国实验动物念珠状链杆菌检测和该菌感染人类的实验室诊断方法的建立提供了技术支持,也为进一步的病原学和流行病学研究提供了技术储备。

全文目录


(一)  5-37
  中文摘要  5-6
  英文摘要  6-7
  前言  7-8
  材料方法  8-22
  结果  22-30
  讨论  30-34
  小结  34-35
  参考文献  35-37
(二)  37-66
  中文摘要  37-39
  英文摘要  39-41
  前言  41-44
  材料方法  44-50
  结果  50-59
  讨论  59-63
  小结  63-64
  参考文献  64-66
致谢  66-67

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家畜 > 猪
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