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破囊壶菌△5-Desaturase基因及其5’端侧翼序列的克隆与功能鉴定

作　者: 夏晓峰
导　师: 黄建忠；江贤章
学　校: 福建师范大学
专　业: 发酵工程
关键词: △5-脂肪酸脱饱和酶 启动子 克隆和表达 破囊壶菌
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


破囊壶菌Thraustochytrium能够合成大量高度不饱和脂肪酸（PUFA）,为探究海洋真菌Thraustochytrium PUFA的生物合成途径,本课题从Thraustochytriumsp.FJN-10中克隆到了PUFA合成相关的Δ5-脂肪酸脱饱和酶基因的cDNA序列（GenBank Accession Number:EU643618）,该序列全长1320bp,编码439个氨基酸,分子量为49.82 KDa,等电点为8.71。该蛋白质序列含有三个保守的组氨酸富集区,且第三个组氨酸保守盒的组氨酸被替换成谷氨酰胺,N-端含有类细胞色素-b5结构域,具有脱饱和酶的典型一级结构特征;氨基酸序列比对分析表明该序列与破囊壶菌Thraustochytrium sp.ATCC21685、Pavlova salina、Perkinsus marinus的Δ5-脂肪酸脱饱和酶分别具有99%、49%和47%的一致性,此外该序列还分别与Mantoniellasquamata和Ostreococcus tauri的Δ6-脂肪酸脱饱和酶具有42%和41%的一致性;进化树分析表明该酶属于Δ5-脂肪酸脱饱和酶家族。将该序列与酵母表达载体pYES2连接构建重组表达载体pYFAD5,并转入酿酒酵母构建重组工程菌,在含底物二高-γ-亚麻酸(di-hono-γ-linoleic acid,DGLA,20:3Δ8,11,14n6)的培养基中添加半乳糖诱导表达,提取总脂肪酸,气相色谱-质谱分析表明重组工程菌能将底物DGLA转化成花生四烯酸(Arachidonic acid,AA,20:4Δ5,8,11,14n6),转化率为56.40%。上述结果表明从海洋破囊壶菌Thraustochytrium sp.FJN-10中克隆的脂肪酸脱饱和酶基因的编码产物具备Δ5-脱饱和酶的功能。利用LA-PCR法克隆得到了海洋破囊壶菌Thraustochytrium sp.FJN-10Δ5-脱饱和酶基因的5′端侧翼序列（GenBank Accession Number:EU918393）,利用多种在线软件对该序列进行分析,分析结果表明该序列包含了多种启动子的特征元件。将该序列与人、斑马鱼、恒河猴、线虫以及褐鼠的Δ5-脱饱和酶基因5′端侧翼序列进行多序列比对,采用邻位相连算法构建距离进化树,进化树结果表明破囊壶菌Thraustochytrium sp.FJN-10的Δ5-脱饱和酶基因的5’端侧翼序列与人类和恒河猴进化距离最近,破囊壶菌Thraustochytrium sp.FJN-10的Δ5-脱饱和酶基因的调控机制比较接近高等脊椎动物,此外FootPrinter的分析也支持了上述结果。为了验证海洋破囊壶菌Δ5-脂肪酸脱饱和酶基因5’端侧翼序列的启动子功能,将该5’端侧翼序列克隆到真核启动子验证表达载体pYGFP质粒中的绿色荧光蛋白基因上游,以真核生物酿酒酵母作为转化的宿主菌,利用荧光显微镜观察酵母的荧光激发状态,实验结果表明来自于破囊壶菌Δ5-脂肪酸脱饱和酶基因5’端侧翼序列能够在酵母细胞中启动GFP基因的表达,使酵母细胞在荧光显微镜的激发下产生绿色荧光,表明克隆的破囊壶菌Δ5-脂肪酸脱饱和酶基因5’端侧翼序列具有启动子的功能。

全文目录


中文摘要  2-4
Abstract  4-6
中文文摘  6-9
目录  9-14
绪论  14-26
  一 高度不饱和脂肪酸  14-15
  二 PUFAs主要生理功能  15
  三 高度不饱和脂肪酸生物合成途径  15-17
    3.1 脂肪酸碳链延长酶和脱饱和酶共催化的生物合成途径  15-16
    3.2 Polyketide synthase(PKS)脂肪酸生物合成途径  16-17
  四 脂肪酸脱饱和酶的研究进展  17-21
    4.1 脂肪酸脱饱和酶  17
    4.2 脂肪酸脱饱和酶的结构特征  17-18
    4.3 脂肪酸脱饱和酶的分子生物学研究进展  18-21
      4.3.1 △15-脂肪酸脱饱和酶  18-19
      4.3.2 △12-脂肪酸脱饱和酶  19
      4.3.3 △9-脂肪酸脱饱和酶  19
      4.3.4 △8-脂肪酸脱饱和酶  19-20
      4.3.5 △6-脂肪酸脱饱和酶  20
      4.3.6 △5-脂肪酸脱饱和酶  20-21
      4.3.7 △4-脂肪酸脱饱和酶  21
  五 脂肪酸脱饱和酶基因启动子的研究进展  21-22
  六 本课题研究的目的和意义  22-24
  七 本课题研究的技术路线  24-26
第一章 Thraustochytrium sp.FJN-10 DHA生物合成途径△5-脱饱和酶基因的克隆与分析  26-40
  第一节 前言  26
  第二节 材料和方法  26-29
    2.1 材料  26-27
      2.1.1 菌株和质粒  26
      2.1.2 主要试剂  26
      2.1.3 培养基及试剂配制  26-27
      2.1.4 主要仪器  27
    2.2 方法  27-29
      2.2.1 破囊壶菌Thraustochytrium sp.FJN-10总RNA的提取  27
      2.2.2 反转录  27-28
      2.2.3 △5-脂肪酸脱饱和酶基因第二链的合成  28
      2.2.4 PCR扩增产物的回收  28
      2.2.5 连接与转化  28
      2.2.6 菌落PCR验证  28-29
      2.2.7 序列测定与分析  29
  第三节 结果与分析  29-37
    3.1 总RNA的提取和检测  29
    3.2 目的基因的扩增  29-30
    3.3 阳性克隆子的筛选与验证  30-31
    3.4 序列测定与同源性分析  31-34
    3.5 △5-脱饱和酶理化表征分析  34
    3.6 疏水分析和跨膜分析  34-35
    3.7 蛋白质的空间结构分析  35-36
    3.8 脱饱和酶的系统进化树分析  36-37
  第四节 小结与讨论  37-40
第二章 Thraustochytrium sp.FJN-10 DHA生物合成途径△5-脱饱和酶基因在酿酒酵母中的表达  40-48
  第一节 前言  40
  第二节 材料和方法  40-43
    2.1 材料  40-41
      2.1.1 菌株和质粒  40
      2.1.2 主要试剂  40-41
      2.1.3 主要培养基及试剂配制  41
      2.1.4 主要仪器  41
    2.2 方法  41-43
      2.2.1 △5-脂肪酸脱饱和酶基因的扩增  41
      2.2.2 重组表达质粒的构建  41-43
      2.2.3 酿酒酵母感受态细胞的制备及转化  43
      2.2.4 酿酒酵母工程菌的诱导表达(参考本实验室(福建师范大学工业微生物教育部工程研究中心)的标准实验方法)  43
      2.2.5 重组表达产物的GC-MS分析  43
  第三节 结果与分析  43-47
    3.1 目的基因DSR5的扩增  43-44
    3.2 重组表达质粒的构建  44-45
    3.3 重组酿酒酵母工程菌的构建  45-46
    3.4 酿酒酵母工程菌的诱导表达  46-47
  第四节 小结与讨论  47-48
第三章 Thraustochytrium sp.FJN-10 DHA生物合成途径△5-脱饱和酶基因5′端侧翼序列的克隆和分析  48-60
  第一节 前言  48
  第二节 材料与方法  48-50
    2.1 材料  48-49
      2.1.1 菌株和质粒  48
      2.1.2 主要试剂及工具酶  48
      2.1.3 主要培养基及试剂配制  48
      2.1.4 主要仪器  48-49
    2.2 方法  49-50
      2.2.1 破囊壶菌Thraustochytrium sp.FJN-10基因组DNA的提取  49
      2.2.2 Thraustochytrium sp.FJN-10 △5-脂肪酸脱饱和酶基因5'端侧翼序列的克隆  49-50
      2.2.3 重组子的筛选和鉴定  50
  第三节 结果与分析  50-57
    3.1 破囊壶菌△5-脱饱和酶基因5'端侧翼序列的LA-PCR扩增  50-51
    3.2 重组子的筛选及鉴定  51
    3.3 LA-PCR产物序列测定与序列分析  51-53
    3.4 启动子的验证和功能注释  53-56
    3.5 △5-脱饱和酶基因5'端侧翼序列的进化树分析  56
    3.6 不同物种△5-脱饱和酶基因启动子序列的转录元件比较分析  56-57
  第四节 小结与讨论  57-60
第四章 Thraustochytrium sp.FJN-10 DHA生物合成途径△5-脱饱和酶基因5′端侧翼序列启动子功能验证  60-66
  第一节 前言  60
  第二节 材料与方法  60-62
    2.1 材料  60-61
      2.1.1 菌株和质粒  60
      2.1.2 主要培养基和试剂  60-61
      2.1.3 主要仪器  61
    2.2 方法  61-62
      2.2.1 海洋破囊壶菌△5-脱饱和酶基因5'端侧翼序列的亚克隆  61
      2.2.2 破囊壶菌△5-脱饱和酶基因5'端侧翼区与GFP报告基因融合表达载体的构建  61-62
      2.2.3 重组酵母工程菌的构建  62
      2.2.4 荧光显微观察鉴定  62
  第三节 结果与分析  62-65
    3.1 海洋破囊壶菌△5-脱饱和酶基因5'端侧翼序列的亚克隆  62-63
    3.2 亚克隆序列的转化和验证  63
    3.3 重组酵母工程菌的转化和验证  63-64
    3.4 细胞荧光显微观察  64-65
  第四节 小结与讨论  65-66
第五章 Thraustochytrium sp.FJN-10 DHA生物合成途径△5-脱饱和酶的定点突变  66-76
  第一节 前言  66
  第二节 材料和方法  66-68
    2.1 材料  66-67
      2.1.1 菌株和质粒  66-67
      2.1.2 主要试剂  67
      2.1.3 培养基及缓冲液  67
      2.1.4 定点突变引物  67
      2.1.5 主要仪器  67
    2.2 方法  67-68
      2.2.1 定点突变PCR条件的摸索  67-68
      2.2.2 突变质粒的转化和验证  68
      2.2.3 突变质粒转化酿酒酵母构建重组工程菌  68
  第三节 结果与分析  68-73
    3.1 海洋破囊壶菌△5-脱饱和酶基因重组质粒pYFAD5的提取  68-69
    3.2 海洋破囊壶菌△5-脱饱和酶基因pYFAD5的定点突变  69
    3.3 突变质粒的转化和验证  69-70
    3.4 突变质粒的测序和分析  70-73
    3.5 突变质粒重组酵母工程菌的构建  73
  第四节 小结与讨论  73-76
第六章 结论  76-78
附录 主要符号对照表  78-80
攻读学位期间承担的科研任务与主要成果  80-82
致谢  82-84
个人简历  84-85
参考文献  85-89

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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