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携带IL-24基因的E1区双调控溶瘤腺病毒治疗肿瘤的研究

作　者: 肖连立
导　师: 刘新垣
学　校: 浙江理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 肿瘤双调控溶瘤腺病毒 Mda-7/IL-24 survivin启动子 Ad·sp·E1A（△24）·E1B（△55）·IL-24
分类号: R73-36
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目前恶性肿瘤已经超越心血管疾病,成为危害人类健康和生命的头号杀手。在世界范围内每年肿瘤患者的发病率和死亡率都急剧增加,而且50年来大部分肿瘤患者的5年生存率并没有发生变化。传统的手术、放疗和化疗对恶性肿瘤的治疗无济于事,肿瘤的复发率和致死率仍然居高不下。由此可见,肿瘤的传统疗法的发展已经举步维艰,人类迫切需要寻找更加有效安全的治疗理念和方法来破除癌症无法治疗的“魔咒”。随着肿瘤的基因治疗和病毒治疗的日益发展,目前以肿瘤特异性增殖腺病毒（即溶瘤腺病毒）为代表的生物疗法已经成为癌症治疗领域的研究热点。此后刘新垣院士融合了基因治疗和病毒治疗的优势提出了一种新型的肿瘤治疗策略:靶向基因-病毒治疗策略,通过溶瘤病毒载体携带一个或多个肿瘤治疗基因来实现对肿瘤细胞的有效杀伤,从而为肿瘤治疗的前景带来了新的曙光与希望。溶瘤腺病毒的改造位点通常选在对病毒复制有重要调控作用的E1区,如通过删除E1B 55kD区域或者E1A CR2区的24bp碱基来分别靶向不同的信号通路。还可以利用肿瘤或组织特异性启动子替代E1A或E1B野生型启动子来限制溶瘤腺病毒在特定的肿瘤或组织中复制增殖。Mda-7/IL-24（melanoma differentiation associated gene-7/interleukin-24）是一种新型的广谱抗肿瘤的多功能细胞因子,能选择性地促进肿瘤细胞凋亡而对正常细胞没有毒害,并具有潜在的“旁观者效应”,而且还能诱导免疫调节反应和抑制肿瘤血管生成。实验室目前已经完成了ZD55-IL-24（E1B 55kD删除）和Ad.sp- E1A_（△24）-IL-24（E1A 24bp删除）两种E1区单调控溶瘤腺病毒的体内与体外实验,结果两者都显示了非常好的肿瘤杀伤与抑制效果。我们将IL-24基因插入到E1A和E1B双调控的溶瘤腺病毒载体Ad·sp·E1A_（△24）·E1B_（△55）中,构建出重组基因病毒Ad·sp·E1A_（△24）·E1B_（△55）·IL-24。体外实验表明Ad·sp·E1A_（△24）·E1B_（△55）·IL-24能诱导多种肿瘤细胞的死亡如肺癌、鼻咽癌、肝癌、结肠癌、宫颈癌等肿瘤细胞,而且肺癌NCI-H460荷瘤裸鼠实验也证明Ad·sp·E1A_（△24）·E1B_（△55）·IL-24能够有效地抑制肿瘤的疯狂增长。本实验首次利用E1A和E1B双调控的溶瘤腺病毒载体携带肿瘤治疗基因IL-24在体外和体内实验中都实现了对肿瘤良好的抑制作用,从而为肿瘤靶向性治疗的研究提供了一个实验参考。

全文目录

摘要  7-8
Abstract  8-10
缩略词  10-13
第一章癌症研究现状和癌症靶向基因病毒治疗的概述  13-20
  1.1 癌症治疗的研究现状  13-15
  1.2 溶瘤腺病毒的发展与研究概述  15-17
    1.2.1 腺病毒的结构特点及腺病毒载体的应用优势和分类  15-16
    1.2.2 肿瘤特异性增殖腺病毒的构建策略  16
    1.2.3 E1 区改造的溶瘤腺病毒的发展过程介绍  16-17
  1.3 Survivin 与肿瘤靶向  17-18
  1.4 肿瘤治疗基因mda-7/IL-24 在肿瘤治疗中的应用简介  18-20
第二章 Survivin 启动子调控 E1A 和E1B 双调控溶瘤腺病毒表达IL-24 蛋白对肿瘤的治疗研究  20-54
  2.1 实验材料  20-23
    2.1.1 菌株与质粒  20
    2.1.2 腺病毒  20
    2.1.3 工具酶及生化试剂  20-21
    2.1.4 细胞株  21-22
    2.1.5 抗体  22
    2.1.6 实验主要仪器  22-23
    2.1.7 合成引物序列  23
  2.2 实验方法  23-40
    2.2.1 重组质粒pAd·sp·E1A_((△24))·E18_((△55))·IL-24 的构建  23-32
      2.2.1.1 质粒pXC2·sp·E1A_((△24))的构建  27-29
      2.2.1.2 质粒pAd·sp·E1A_((△24))·E18_((△55))的构建  29
      2.2.1.3 质粒p Ad·sp·E1A_((△24))·E18_((△55))·IL-24 的构建  29-32
    2.2.2 重组腺病毒的包装、纯化、扩增和滴定  32-36
      2.2.2.1 重组腺病毒的包装  32
      2.2.2.2 病毒Ad·sp·E1A_((△24))·E18_((△55))·EGFP和Ad·sp·E1A_((△24))·E18_((△55))·IL-24的纯化  32-33
      2.2.2.3 重组病毒鉴定  33-34
      2.2.2.4 重组病毒的大量制备与CsCl 梯度离心纯化病毒  34
      2.2.2.5 重组病毒的滴度测定  34-36
    2.2.3 溶瘤腺病毒Ad·sp·E1A_((△24))·E18_((△55))·IL-24 体外抗瘤效果评价  36-39
      2.2.3.1 MTT 法检测肿瘤细胞存活率  36
      2.2.3.2 结晶紫实验检测Ad·sp·E1A_((△24))·E18_((△55))·IL-24 对肿瘤细胞的毒性  36
      2.2.3.3 Hoechst 33342 染色观察细胞凋亡  36-37
      2.2.3.4 Western Blot 实验  37-39
    2.2.4 溶瘤腺病毒Ad·sp·E1A_((△24))·E18_((△55))·IL-24 体内抗瘤效果评价  39-40
      2.2.4.1 肺癌H460 荷瘤裸鼠模型的建立及瘤内注射  39-40
    2.2.5 统计学分析  40
  2.3 实验结果  40-52
    2.3.1 重组质粒的的鉴定  40-42
      2.3.1.1 质粒pXC2·sp·E1A_((△24))的鉴定  40-41
      2.3.1.2 质粒 pAd·sp·E1A_((△24))·E1B_((△55))的鉴定  41
      2.3.1.3 重组质粒 pAd·sp·E1A_((△24))·E1B_((△55))·IL-24 的鉴定  41-42
    2.3.2 重组溶瘤腺病毒的鉴定  42-43
    2.3.3 survivin 启动子高效驱动重组病毒早期基因 E1A 在肿瘤细胞中的表达  43-44
    2.3.4 溶瘤腺病毒Ad·sp·E1A_((△24))·E1B_((△55))·IL-24可在肿瘤细胞中高效表达IL-24蛋白  44-45
    2.3.5 MTT 法检测溶瘤病毒 Ad·sp·E1A_((△24))·E1B_((△55))·IL-24 对肿瘤细胞的体外杀伤效果  45-48
    2.3.6 结晶紫实验分析溶瘤病毒 Ad·sp·E1A_((△24))·E1B_((△55))·IL-24 对肿瘤细胞的毒性  48-49
    2.3.7 凋亡细胞的染色实验  49-50
    2.3.8 Western blot 检测凋亡通路中关键蛋白的表达  50-51
    2.3.9 Ad·sp·E1A_((△24))·E1B_((△55))·IL-24 能有效抑制荷瘤小鼠的肿瘤生长  51-52
  2.4 讨论与展望  52-54
参考文献  54-58
致谢  58-59
硕士研究生期间的研究成果  59

携带IL-24基因的E1区双调控溶瘤腺病毒治疗肿瘤的研究

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