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人工miR159介导的番茄抗黄瓜花叶病毒遗传转化研究

作　者: 徐艳
导　师: 陈集双；廖乾生
学　校: 浙江理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 番茄组培扩繁人工miRNA 黄瓜花叶病毒遗传转化
分类号: S642.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

MicroRNA(miRNA)是一类长度在21～24nt的、广泛存在于真核生物中的非编码小RNA,它们通过与靶标mRNA的结合来发挥相应的负控调节等作用。miR159是一类高度保守的miRNA,因此人们推测它可能存在于所有的陆地植物中。初步研究表明,miR159可能与一些植物花药和种子的产生相关。已有报道发现番茄中的miR159在叶片中的本底表达量较高,但是它在番茄中的具体功能目前还是未知的。近年来关于小RNA介导的基因沉默相关研究较为热门,相关研究显示虽然与miRNA结构和功能相似的siRNA具有一定的基因沉默效应,但是由于其表达不够稳定、对靶标序列识别的专一性不足等缺点,其应用前景具有较大局限性和不确定性。而miRNA则由于其内源性、表达量比较高、与靶标结合更稳定和专一等优点,被认为是基因沉默研究的新热点。黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)是较为典型的三分体正义单链(positive single strand RNA, +ssRNA)病毒。它具有较为广泛的宿主,主要引起寄主花叶、矮化、绿岛、褪绿、黄化等症状,从而严重影响了植物的正常生长发育。番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)是人们日常生活中不可或缺的蔬菜型水果,提高其产量和品质的相关研究长期以来一直是热点。CMV也是引起的番茄病毒病的主要病因之一,每年因CMV造成的农业减产给经济发展和工农业生产带来了严重影响,因而研究与抗CMV相关的番茄遗传转化具有十分重要的科研价值和经济意义。本研究结合上述miRNA介导的基因沉默、番茄抗病毒相关的转基因等研究热点,主要通过人工改造的miR159对番茄进行遗传转化,并在此过程中对各个操作条件进行优化,从而初步建立了人工miR159介导的番茄抗黄瓜花叶病毒遗传转化体系。本文的主要内容分为三部分:一、通过对受体番茄Micro Tom的组培快繁及抗生素耐受性培养条件的筛选,确定了最适的分化外植体、培养条件以及分化、生根培养基配方,从而建立了Micro Tom遗传转化研究的基础。其中分化培养基配方为:MS+0.25 mg/L IAA+2mg/L 6-BA;生根培养基配方为:MS+0.5 mg/L IBA;抗生素耐受性植株高效筛选浓度配比为:50mg/L卡那霉素+200mg/L头孢霉素。二、构建含人工miR159前体(pre-amiR159)的质粒pBI121- (pre-amiR159),再用该质粒分别转化农杆菌EHA105和番茄Micro Tom,筛得到抗性番茄再生植株若干,从而初步建立了番茄amiR159介导的遗传转化体系。其中质粒的构建方法为:从CMV-Fny的RNA1上的ORF片段中筛选一段21bp的序列作为amiR159的靶标,根据此序列的互补片段设计出前体amiR159序列,人工合成前体amiR159的cDNA序列后,再将此序列连接到质粒pBI121上相应的位点。番茄的遗传转化过程主要为:通过用上述质粒转化的农杆菌侵染番茄外植体、在筛选性培养上筛选抗性再生植株等过程,初步筛选出抗性植株。在此实验过程中同时研究并优化了外植体预处理方法、农杆菌侵染浓度、农杆菌侵染时间等处理条件。三、通过对抗性番茄植株进行分子鉴定和相应的攻毒实验,得到转基因阳性植株抗CMV的综合数据,从而从抗CMV的功能性上验证了amiR159介导的番茄遗传转化体系的有效性。分子鉴定主要是通过PCR、Southern杂交方法鉴定抗性植株基因组DNA中的目的片段、RT-PCR方法鉴定抗性植株中目的RNA的表达情况,从而确定转基因阳性番茄。攻毒实验主要是对炼苗成功的转基因阳性番茄接种靶标病毒CMV-Fny,并于一定时间后进行抗病效果的检测。通过与未接病毒的番茄比较,发现转基因阳性番茄对于靶标病毒CMV-Fny具有一定的抗性,主要表现在与普通番茄相比症状减轻或不感病、植株整体生长情况良好,等等。综合这三部分的研究成果,本文初步筛选并建立了番茄amiR159抗黄瓜花叶病毒的遗传转化体系。

人工miR159介导的番茄抗黄瓜花叶病毒遗传转化研究

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