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粘毛黄芩F3H基因表达载体构建及转化烟草研究

作　者: 李鹏
导　师: 孙敏
学　校: 西南大学
专　业: 植物学
关键词: 粘毛黄芩 F3H基因黄酮类化合物载体构建遗传转化
分类号: S567.239
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

粘毛黄芩(Scutellaria viscidula Bge.)为唇形科黄芩属植物,具有抗炎、抗癌、抗氧化等多种生物活性。其药理作用有效成分主要是黄酮类化合物,其临床需求量增加迅速,而粘毛黄芩野生资源破坏严重,野生资源面临枯竭,无法满足人们的需要。黄烷酮3-羟化酶(flavanone 3-hydroxylase, F3H)基因是整个黄酮类化合物代谢途径的中枢位点,调控着合成途径中的代谢流向。它催化柚皮素生成二氢黄酮醇(DHK),而DHK是黄酮类化合物生物合成中生成黄酮、花色素和异黄酮等黄酮类化合物的重要中间产物。为了研究粘毛黄芩黄酮化合物生物合成途径,进而为提高粘毛黄芩体内的黄芩苷含量奠定基础。本研究采用基因超表达和反义抑制研究粘毛黄芩F3H基因的功能,构建了F3H基因超表达和反义植物载体,转化烟草植株,并测定了总黄酮含量,获得的主要结果如下：1、F3H基因原核表达载体的构建用RT-PCR扩增目的基因Svf3h连接pMD19-T克隆载体,测序正确后,双酶切含目的基因的克隆载体pMD19-Svf3h和表达载体质粒pQE30,将目的片段Svf3h与载体pQE30酶切大片段连接,构建成原核表达载体pQE30-Svf3h转化原核表达菌M15,经检测验证,得到原核表达菌M15-pQE30-Svf3h。2、F3H基因正、反义植物表达载体的构建及农杆菌菌株的转化酶切植物克隆表达载体pCXSN质粒,RT-PCR扩增目的基因Svf3h,回收目的片段与载体,构建成Svf3h的正、反义植物表达载体,结果构建了1种正义pCXSN-Svf3h,2种反义表达载体pCXSN-antiSvf3h,将验证正确的植物表达载体转入农杆菌EHA105,得到EHA105-Svf3h/anti Svf3h农杆菌工程菌。3、根癌农杆菌介导的F3H基因对烟草的遗传转化及PCR鉴定观察转化的烟草再生过程发现转化F3H基因的烟草植株与未转化烟草植株,在形态上并无明显的差异。根据已知粘毛黄芩F3H基因、潮霉素基因序列设计特异引物,对转化的烟草植株进行PCR检测。PCR分析显示,正、反义Svf3h均被整合到烟草基因组中,筛选得到8株阳性反义烟草植株,6株阳性正义烟草植株。4、转SvF3H烟草总黄酮含量的测定各选5株PCR检测结果阳性转化植株,3株未转化烟草植株作为对照,提取叶片中的总黄酮,用比色法测量其相对含量。结果表明,正义烟草植株总黄酮的平均含量为2.19%明显高于反义植株总黄酮类化合物1.39%的含量。阳性正义烟草植株总黄酮的含量与反义烟草阳性植株以及未转化烟草植株的黄酮含量有明显的差异。

粘毛黄芩F3H基因表达载体构建及转化烟草研究

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