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体细胞克隆胚胎生产及其DNA甲基化研究

作　者: 鞠光伟
导　师: 朱化彬
学　校: 中国农业科学院
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 牛同种克隆马-牛克隆体外受精 Peg10 H19 甲基化
分类号: Q813
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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引　用: 2次
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内容摘要

效率低下对体细胞克隆技术的应用形成了巨大的障碍。在体细胞克隆过程中,供体细胞核必须先去分化,再重编程为具有全能性的胚胎模式。DNA甲基化是一种主要的表观遗传修饰,对于胚胎发育、胎盘及胎儿的生长具有重要作用。本实验检测了两个基因在牛体外受精、牛同种及马-牛异种克隆胚胎着床前各发育时期的甲基化状态,为研究DNA甲基化在克隆中的作用奠定基础。1.牛同种克隆、马-牛克隆及体外受精胚胎的制备①分别以牛耳缘成纤维细胞、马胎儿成纤维细胞为供体构建同种、异种克隆胚胎。结果发现,虽然异种克隆的融合率显著高于同种克隆(82.36%vs75.58%,p<0.05),分裂率差异不显著(85.32%vs88.41%,p>0.05),但囊胚率却远远小于同种克隆(35.69%vs4.38,p<0.01)。②以体外成熟卵母细胞和冷冻精液获得的牛体外受精胚胎具有较高的分裂率(86.25%)和囊胚率(46.87%)。2.Peg10、H19基因在同种克隆与体外受精胚胎中的甲基化水平①在Peg10基因,相对于体外受精胚胎,同种克隆胚胎在2-cell、桑葚胚和囊胚阶段的DNA甲基化水平显著升高(p<0.05),而4-cell(p<0.01)和8~16-cell(p<0.05)显著降低,推测其进行了过早的去甲基化和重新甲基化,克隆胚胎发育阶段的高甲基化、去甲基化和重新甲基化的异常可能是导致克隆动物异常的一个原因。②对于H19基因,2-cell(p<0.05)和4-cell(p<0.01)期,同种克隆胚胎的DNA甲基化水平显著高于体外受精胚胎,而桑葚胚与囊胚阶段则显著降低(p<0.01),推测直到桑葚胚及囊胚阶段才发生去甲基化,且去甲基化并不充分、重新甲基化也不完全。因此去甲基化异常以及剧烈的甲基化水平波动可能是克隆异常的原因之一。3. Peg10、H19基因在异种克隆胚胎中的甲基化水平①在Peg10基因,除囊胚外,异种克隆胚胎各发育阶段的DNA甲基化水平与同种克隆相似,囊胚的甲基化水平均显著降低于体外受精与同种克隆(p<0.01)。推测其发育阶段进行了异常的去甲基化和重新甲基化。②对于H19基因,异种克隆胚胎在1-cell、2-cell及囊胚期DNA甲基化水平相对于体外受精和同种克隆均显著降低(p<0.01),8-16cell阶段显著升高(p<0.01),推测其先进行了较早的重新甲基化,而后又进行了异常的去甲基化。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-12
第一章文献综述  12-20
  1.1 体细胞克隆概述  12-14
  1.2 甲基化综述  14-17
    1.2.1 甲基化的维持、去甲基化和重新甲基化  14
    1.2.2 甲基化的功能  14-16
    1.2.3 DNA 甲基化的检测方法  16-17
  1.3 DNA 甲基化与体细胞克隆  17-18
  1.4 Peg10 与H19 基因的结构与功能  18-19
    1.4.1 Peg10  18
    1.4.2 H19 基因  18-19
  1.5 本实验的技术路线  19-20
第二章牛同种、异种克隆及体外受精胚胎的制备  20-37
  2.1 实验材料  20-25
    2.1.1 主要仪器设备  20-21
    2.1.2 主要化学试剂  21
    2.1.3 主要溶液的配制  21-24
    2.1.4 显微操作针的拉制  24-25
  2.2 实验方法  25-30
    2.2.1 牛耳组织的采取  25
    2.2.2 耳成纤维细胞的原代培养  25
    2.2.3 耳成纤维细胞的传代、冷冻、复苏  25-26
    2.2.4 马胎儿成纤维细胞的培养  26-27
    2.2.5 克隆胚胎的构建  27-29
    2.2.6 牛体外受精  29-30
  2.3 实验结果  30-34
    2.3.1 原代细胞的生长  30-31
    2.3.2 传代细胞的生长  31
    2.3.3 卵母细胞的成熟  31-32
    2.3.4 卵母细胞的去核  32-33
    2.3.5 核移植后融合率  33
    2.3.6 克隆胚胎的发育  33-34
    2.3.7 牛体外受精胚胎的发育  34
  2.4 讨论  34-36
  2.5 结论  36-37
第三章 Peg10、H19 基因在同种克隆、体外受精着床前胚胎中的甲基化状态  37-50
  3.1 材料与方法  37-40
    3.1.1 主要仪器  37
    3.1.2 主要试剂  37
    3.1.3 实验方法  37-40
  3.2 实验结果  40-48
    3.2.1 CpG 岛的预测及PCR 扩增、克隆、测序  40-42
    3.2.2 同种克隆、体外受精胚胎的甲基化状态分析  42-47
    3.2.3 Peg10、H19 基因在各时期胚胎中的甲基化水平总结  47-48
  3.3 讨论  48-49
  3.4 结论  49-50
第四章 Peg10、H19 基因在马-牛异种克隆着床前胚胎中的甲基化状态  50-60
  4.1 材料与方法  50-52
    4.1.1 主要仪器  50
    4.1.2 主要试剂  50
    4.1.3 实验方法  50-52
  4.2 实验结果  52-59
    4.2.1 CpG 岛的预测及PCR 扩增、克隆、测序  52-54
    4.2.2 马-牛异种克隆胚胎的甲基化状态分析  54-57
    4.2.3 Peg10、H19 基因在各时期胚胎中的甲基化水平总结  57-59
  4.3 讨论  59
  4.4 结论  59-60
第五章全文结论  60-61
  5.1 同种、异种克隆胚以及牛体外受精胚胎的制备  60
  5.2 Peg10、H19 基因在同种克隆、体外受精胚胎中的甲基化状态  60
  5.3 Peg10、H19 基因在马-牛异种克隆胚胎中的甲基化状态  60-61
参考文献  61-66
致谢  66-67
作者简历  67

体细胞克隆胚胎生产及其DNA甲基化研究

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