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组蛋白去甲基化酶Jhd2、JMJD5的结构生物学探索及金黄色葡萄球菌HssSR的表达纯化

作　者: 陈妮妮
导　师: 臧建业
学　校: 中国科学技术大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 核小体甲基化组蛋白去甲基化酶 JmjC结构域血红素二组分系统组氨酸激酶自磷酸化
分类号: Q93
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

一、组蛋白去甲基化酶Jhd2、JMJD5的结构生物学研究在真核细胞中,核小体是染色质的基本组成单位,其核心由组蛋白八聚体和缠绕1.75圈的DNA组成。组蛋白尾巴可发生多种翻译后修饰过程,包括乙酰化、磷酸化、甲基化、泛素化、ADP-核糖基化等。其中甲基化修饰在基因转录调节、异染色质形成、基因组完整性的维持及细胞发育等过程中起重要作用。组蛋白的甲基化发生在赖氨酸的ε-氨基或者精氨酸的胍基上,其中以组蛋白H3和H4上赖氨酸的甲基化最为常见,如H3K4、H3K9、H3K27、H3K36、H3K79、H4K20等。这些位置的赖氨酸残基可发生一甲基化、二甲基化和三甲基化修饰。原来认为甲基化是一种稳定修饰,去甲基化酶的发现说明该修饰是可逆的过程。Jhd2(酿酒酵母)、JMJD5(人)都属于一类包含Jumonji结构域的组蛋白去甲基化酶,它们都以特征性的JmjC结构域为酶活性中心,催化组蛋白的去甲基化修饰。这类去甲基化酶发挥酶活性时需要二价铁离子(Fe2+)和α-酮戊二酸的参与,两者的催化机理很相似,但是它们具有不同的底物选择性:Jhd2可特异性催化底物H3K4me3/me2的去甲基化,JMJD5可特异性催化底物H3K36me2的去甲基化。因此,对Jhd2、JMJD5的结构探索,有助于理解此类酶的催化机制。本论文对Jhd2、JMJD5进行基因的分子克隆、蛋白表达、纯化及结晶条件筛选,目前仍未获得蛋白质晶体。对JMJD5进行三维结构预测,并将JMJD5和已有结构的同源蛋白质进行多序列比对,推测决定底物甲基化状态选择性的关键氨基酸残基。二、金黄色葡萄球菌HssS、HssR的克隆表达纯化与晶体筛选金黄色葡萄球菌是对全球人类健康造成威胁的重要致病菌之一,其侵染人体并导致包括皮肤和软组织感染、心内膜炎、败血症等多种疾病。宿主体内的铁元素是金黄色葡萄球菌侵染过程中重要的营养需求之一,而金属离子是多种生物化学过程如酶催化反应中必须的辅因子。铁元素在脊椎动物细胞中主要以亚铁血红素的形式存在,后者又是血红蛋白和肌红蛋白的重要组成部分。但是当金黄色葡萄球菌摄入高浓度的血红素后,会对自身产生毒害作用,因为亚铁离子被氧化成高铁离子的同时产生超氧阴离子自由基,后者会破坏细胞膜甚至杀死细胞。研究发现金黄色葡萄球菌中由HssS、HssR组成的二组分系统通过感受高浓度血红素的信号可调控分泌系统HrtAB的表达,后者可将细胞内多余的血红素分泌到胞外,从而增强金黄色葡萄球菌对高浓度血红素毒性的耐受能力。HssS是典型的组氨酸激酶,当其感受血红素分子刺激时,第249位组氨酸发生自磷酸化,并将磷酸基团转移到效应蛋白HssR上,活化的HssR作用于HrtAB启动子区的正向重复序列并促进其表达。对HssS和HssR及其复合物进行结构生物学上的研究,有助于解释血红素识别及信号传导的分子机制。已对HssS的胞内片段和HssR的全长进行基因的分子克隆、蛋白表达、纯化及结晶条件筛选的尝试,同时也通过GST-Pull Down实验验证了两者的相互作用,并做了复合物结晶条件的筛选。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-10
第一篇组蛋白去甲基化酶 Jhd2、JMJD5 的结构生物学研究  10-55
  第一章组蛋白去甲基化酶的研究背景  11-21
    1.1 染色质与组蛋白甲基化修饰  11-12
    1.2 组蛋白去甲基化与去甲基化酶  12-17
      1.2.1 去甲基化酶的类型  13
      1.2.2 LSD1 的催化机理与结构特征  13-15
      1.2.3 JHDM 家族去甲基化酶的催化机理与结构特征  15-17
    1.3 Jhd2 和JMJD5 的研究概况  17-21
      1.3.1 Jhd2  18-20
      1.3.2 JMJD5  20-21
  第二章实验材料和方法  21-31
    2.1 Jhd2-PHD 及JMJD5 截短体的基因克隆与重组质粒构建  21-24
      2.1.1 引物设计  21
      2.1.2 PCR 扩增及片段回收  21-22
      2.1.3 双酶切与连接  22-23
      2.1.4 转化涂板、菌落PCR 及抽提质粒并做双酶切鉴定  23-24
    2.2 Jhd2 和JMJD5 截短体的蛋白表达与鉴定  24-25
    2.3 Jhd2 和JMJD5 截短体的蛋白纯化  25-27
      2.3.1 两步纯化法- 适用于大部分截短体蛋白  25-26
      2.3.2 四步纯化法-适用于MBP-JMJD5(170-C)  26-27
    2.4 Jhd2-PHD 及JMJD5 截短体的晶体筛选  27
    2.5 JMJD5 突变体设计及表达纯化  27-31
      2.5.1 JMJD5 突变体的分子克隆  27-28
      2.5.2 JMJD5 突变体的表达纯化  28-31
  第三章实验结果与讨论  31-50
    3.1 基因克隆及重组质粒构建  31-33
    3.2 蛋白表达纯化与鉴定  33-44
      3.2.2 Jhd2-PHD 截短体的纯化  34-38
      3.2.3 JMJD5 截短体的表达与纯化  38-44
    3.3 Jhd2 和JMJD5 的晶体初筛  44-46
    3.4 JMJD5 及突变体的克隆与表达纯化  46-50
  小结  50-51
  参考文献  51-55
第二篇金黄色葡萄球菌 HssS、HssR 的克隆表达纯化  55-83
  第一章综述HssS/HssR 的研究背景  57-63
    1.1 概述  57-58
    1.2 HssRS/HrtAB 系统  58-63
      1.2.1 HssRS/HrtAB 的研究进展  58
      1.2.2 组氨酸激酶的结构研究  58-59
      1.2.3 研究展望  59-63
  第二章实验材料与方法  63-69
    2.1 HssS 截短体和HssR 全长重组质粒的构建  63-67
      2.1.1 引物设计和PCR  63-64
      2.1.2 PCR 及回收目的片段  64-65
      2.1.3 双酶切与连接  65
      2.1.4 转化涂板、菌落PCR 及抽提质粒并做双酶切鉴定  65-67
    2.2 HssS 截短体和HssR 全长的表达纯化与结晶  67-68
      2.2.1 HssS 截短体和HssR 全长的诱导表达与鉴定  67
      2.2.2 HssS 截短体和HssR 的纯化与结晶  67-68
    2.3 HssS 截短体与HssR 的Pull-Down 实验与复合物晶体筛选  68-69
  第三章实验结果与讨论  69-79
    3.1 基因克隆及重组质粒构建  69-70
    3.2 蛋白表达纯化与结晶  70-77
      3.2.1 HssR 及HssS 截短体的诱导表达与鉴定  70-71
      3.2.2 HssS 截短体和HssR 的纯化与结晶  71-77
    3.3 Pull-Down 实验及HssS/HssR 复合物结晶筛选  77-79
  小结  79-80
  参考文献  80-83
附录  83-87
致谢  87

组蛋白去甲基化酶Jhd2、JMJD5的结构生物学探索及金黄色葡萄球菌HssSR的表达纯化

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