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酵母双杂交筛选NLRP3相互作用蛋白质

作　者: 徐广
导　师: 李爱玲
学　校: 中南大学
专　业: 生物学
关键词: 固有免疫 NLRP3 炎症小体 酵母双杂交
分类号:
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


摘要：在哺乳动物体内,存在多套免疫识别系统,通过维持机体与共生菌群的正常互动以及响应外来病原和刺激的免疫反应,从而维持组织稳态。与主要识别微生物来源病原相关分子模式的、存在于内吞体和细胞膜上的Toll-like receptors (TLRs)不同,定位于胞内的Nod-like receptors (NLRs)不仅识别胞内病原相关分子模式,也识别宿主来源的损伤相关分子模式,比如机体因胁迫、组织损伤和细胞死亡而产生的内源危险信号。NLRs是重要的胞质内模式识别受体,研究发现其大多数成员能构成一个大的分子平台,如最初发现由NLRP1、ASC、caspase-1和caspase-5构成,这个大的复合物被定义为"inflammasome",即炎症小体,它被证明是促炎细胞因子IL-1β (Interleukin-1β)活化所必需的。之后,许多NLRs[2-5]家族和PYHINs家族的感受蛋白也相续被证明能在各种Damage-associated molecular patterns (DAMPs)和Pathogen-associated molecular patterns (PAMPs)刺激下形成功能性炎症小体。现在,炎症小体的提出已被公认为细胞内免疫监视系统里程碑式的发现。机体内,炎症小体广泛参与了抗微生物感染的先天性免疫反应,其中研究得最广泛、最深入的就是NLRP3(NLR family, pyrin domain containing3)炎症小体。基于NLRP3炎症小体的分子靶向治疗目前也正在研究当中。因此,深入发掘NLRP3信号通路分子调控机制,有可能为揭示炎症、免疫及疾病之间的相互关系提供重要依据,同时为某些疾病治疗提供新的靶点。近年来,通过对NLRP3炎症小体及其相互作用蛋白质的研究,增加了人们对NLRP3功能调控的认识。因此,为进一步探索关于炎症小体的信号调控机制及其生物学功能提供基础,本项研究通过酵母双杂交的技术手段筛选与NLRP3相互作用的蛋白质。以NLRP3三个基本结构域PYD、NACHT、LRR为诱饵,在人白细胞cDNA文库中筛选其相互作用蛋白质。经过酵母细胞内进一步验证,我们从87个初步阳性克隆中筛选出了4个与NLRP3相互作用的候选阳性克隆,即ECHS1(enoyl CoA hydratase, shortchain,1)、 UBE2I(ubiquitinconjugating enzyme E2I)、RPL34(ribosomal protein L34)以及PXN(paxillin)。进一步在真核细胞内验证了这些候选蛋白质与NLRP3的相互作用,免疫共沉淀实验(Co-IP)表明ECHS1能够结合NLRP3。本项研究发现NLRP3和ECHS1的相互作用可能是一个新的NLRP3调控因素,进一步深入研究有可能发现一个关于NLRP3功能调控的新机制。图15幅,表3个,参考文献58篇

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-8
目录  8-10
缩略词表  10-11
1 绪论  11-17
2 实验材料及方法  17-28
  2.1 材料与来源  17-20
    2.1.1 菌株与质粒  17
    2.1.2 主要试剂及实验仪器  17-18
    2.1.3 主要试剂配制  18-20
  2.2 实验方法  20-28
    2.2.1 诱饵表达载体pGBKT7-NLRP3(PYD)、pGBKT7-NLRP3(NACHT)、pGBKT7-NLRP3(LRR)的构建  20-23
    2.2.2 文库扩增  23
    2.2.3 酵母细胞的转化  23-24
    2.2.4 酵母蛋白的提取  24-25
    2.2.5 免疫印记(Western Blot)分析  25
    2.2.6 酵母质粒的提取  25-26
    2.2.7 大肠杆菌DH5α感受态的制备  26
    2.2.8 酵母质粒的转化  26
    2.2.9 细胞培养和转染  26-27
    2.2.10 免疫共沉淀(Co-IP)  27-28
3 实验结果  28-41
  3.1 诱饵表达载体的构建和鉴定  28-32
  3.2 诱饵蛋白在酵母细胞中的表达鉴定  32
  3.3 诱饵蛋白在酵母细胞中的毒性验证及自身转录激活活性的测定  32-33
  3.4 人白细胞cDNA文库(Human Leukocyte MatchmakerTM cDNA Library)的扩增  33-34
  3.5 初步筛选结果  34-35
  3.6 重复验证结果  35-38
  3.7 筛选蛋白ECSH1的克隆及表达鉴定  38-39
  3.8 酵母筛选候选蛋白质ECHS1与NLRP3的相互作用验证  39-41
4 总结  41-42
5 实验讨论  42-45
参考文献  45-49
攻读硕士学位期间主要的研究成果目录  49-50
致谢  50-51

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