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鸡贫血病毒蛋白相互作用域定位研究

作　者: 孙芬芬
导　师: 王笑梅
学　校: 中国农业科学院
专　业: 预防兽医学
关键词: 鸡贫血病毒(CAV) 酵母双杂交系统蛋白相互作用作用域定位
分类号: S858.31
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

鸡传染性贫血病(Chicken Infectious Anemia, CIA)是由鸡贫血病毒(Chicken anemia virus, CAV)引起的危害2~3周龄雏鸡的一种免疫抑制病。临床症状表现为病鸡再生障碍性贫血,该病造成的免疫抑制使感染鸡对IBD、MD、ND等疾病的易感性增强。CAV编码3种蛋白,VP1蛋白为病毒的结构蛋白,VP2和VP3蛋白为病毒的非结构蛋白。蛋白质之间的相互作用,以及其中复杂的网络联系成为研究病毒复制以及致病力的关键因素。因此,深入开展鸡贫血病毒自身蛋白相互作用研究将有利于进一步了解病毒蛋白的生物学功能和病毒复制过程。本研究利用酵母双杂交系统、免疫共沉淀、激光共聚焦等技术,研究了贫血病毒3个蛋白之间的相互作用,取得了如下成果:免疫共沉淀和激光共聚焦试验需要用到不同种属的抗体,所以本试验首先制备了病毒蛋白相应兔源多克隆抗体。以CAV M9905株基因组DNA为模板,分别以VP1的小片段(962bp)以及全长VP2和VP3引物进行PCR扩增,扩增产物经双酶切后克隆到原核表达载体pET28a或pET30a上,得到pET28a-VP1(962bp)、pET28a-VP2和pET30a-VP3重组子。经诱导表达、纯化、复性后,免疫新西兰白兔,制备了抗3种蛋白的兔源抗血清。间接ELISA、IFA及Western blot分析结果表明,制备的多克隆抗体具有良好反应性和特异性。为研究鸡贫血病毒VP1、VP2和VP3蛋白之间的相互作用,本研究首先利用Proqest GAL4启动子的酵母双杂交系统对病毒3个蛋白间的相互作用进行了检测。构建诱饵载体pDEST-32-VP1/VP2/VP3和捕获载体pDEST-22-VP1/VP2/VP3,经醋酸锂法分别共转化酵母菌株MaV203,通过对报告基因His、LacZ及URA的检测,筛选到2组阳性重组子,分别为pDEST32-VP2+pDEST22-VP1和pDEST32-VP22+pDEST22-VP3,酵母双杂交检测结果初步证明CAV VP1与VP2蛋白存在相互作用,并首次发现了VP2与VP3蛋白之间存在相互作用。为了进一步验证它们的相互作用,本研究进一步利用免疫共沉淀试验和激光共聚焦试验,对酵母双杂交试验结果进行了验证,从而得出VP1与VP2蛋白,以及VP2与VP3蛋白之间存在相互作用。为了进一步确定蛋白相互作用域,本研究在证明了CAV VP1与VP2蛋白、VP2与VP3蛋白相互作用的基础上,又对蛋白相互作用域进行了精确定位,根据对病毒的3个蛋白的亲水性、抗原性、表面可及性等分析,通过缺失突变的方法设计构建了相应缺失片段的酵母双杂交载体,根据报告基因表型进行筛选,筛选结果为:VP1-VP2蛋白:VP1 N端分别缺失59、86、117、167个氨基酸,或C端缺失36和95个氨基酸后仍能与VP2反应,初步确定相互作用域位于VP1蛋白的168~354位氨基酸。VP2 N端缺失30个氨基酸后,仍与VP1蛋白相作用,说明VP2 N端不影响这两个蛋白的相互作用,VP2的C端为蛋白相互作用的主要区域,相互作用域位于VP2蛋白的31~217位氨基酸。VP2-VP3蛋白:VP2 N端缺失30个氨基酸后不能够与VP3蛋白相作用,但C端缺失17个氨基酸后,仍与VP3蛋白相作用,初步确定相互作用域位于VP2蛋白的1~199位氨基酸。VP3 N端缺失45个氨基酸,仍能与VP2反应。VP3蛋白通过C端与VP2蛋白相互作用,相互作用域位于VP3蛋白的46~122位氨基酸。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-14
第一章引言  14-24
  1.1 CIA 概况  14
  1.2 CAV 病原学  14-18
    1.2.1 CAV 病毒学分类与结构特性  14-15
    1.2.2 CAV 理化特性  15
    1.2.3 CAV 培养、复制及转录  15-16
    1.2.4 CAV 基因编码蛋白及功能研究  16-18
  1.3 蛋白与蛋白相互作用研究的相关技术  18-22
    1.3.1 噬菌体表面呈现技术  18-19
    1.3.2 串联亲和纯化技术  19
    1.3.3 免疫共沉淀技术  19-20
    1.3.4 GST 融合蛋白沉降技术  20
    1.3.5 酵母双杂交系统  20-21
    1.3.6 蛋白质芯片技术  21-22
  1.4 鸡贫血病毒蛋白与蛋白相互作用研究进展  22
  1.5 本研究的目的及意义  22-24
第二章鸡贫血病毒蛋白多克隆抗体的制备  24-33
  2.1 材料和方法  24-28
    2.1.1 菌株与质粒  24
    2.1.2 实验动物  24
    2.1.3 主要仪器  24-25
    2.1.4 试剂与药品  25
    2.1.5 试剂配制  25-26
    2.1.6 CAV VP1、VP2 和VP3 基因的克隆与表达  26-27
    2.1.7 融合蛋白多克隆抗体的制备  27
    2.1.8 融合蛋白多克隆抗体的鉴定  27-28
  2.2 结果  28-31
    2.2.1 目的基因克隆及鉴定结果  28
    2.2.2 蛋白的融合表达及鉴定  28-29
    2.2.3 兔抗VP1、VP2 和VP3 多克隆抗体的效价测定  29
    2.2.4 制备的多克隆抗体与真核表达的VP1、VP2 和VP3 蛋白反应原性检测  29-30
    2.2.5 制备的多克隆抗体Western blot 分析  30-31
  2.3 讨论  31-33
    2.3.1 大肠杆菌表达系统  31
    2.3.2 鸡贫血病毒VP1 蛋白的原核表达  31-32
    2.3.3 鸡贫血病毒非结构蛋白的原核表达  32-33
第三章鸡贫血病毒VP1、VP2 和VP3 蛋白之间的相互作用研究  33-47
  3.1 材料与方法  33-39
    3.1.1 病毒、菌株、质粒、抗体、细胞  33
    3.1.2 试剂与药品  33-35
    3.1.3 相关试剂配制方法  35-36
    3.1.4 鸡贫血病毒VP1、VP2 和VP3 基因酵母双杂交载体的构建  36
    3.1.5 酵母双杂交重组诱饵质粒的转化及自激活性的检测  36-37
    3.1.6 酵母双杂交载体共转化Mav203 酵母感受态细胞  37
    3.1.7 VP1、VP2 和VP3 真核表达及IFA、Western blot 分析  37-38
    3.1.8 免疫共沉淀试验（Co-IP）  38-39
    3.1.9 激光共聚焦试验  39
  3.2 结果  39-44
    3.2.1 鸡贫血病毒VP1、VP2 和VP3 基因酵母双杂交载体的构建  39-40
    3.2.2 构建的诱饵载体自激活作用的鉴定  40-41
    3.2.3 酵母双杂交筛选结果  41-42
    3.2.4 免疫共沉淀试验结果  42-43
    3.2.5 激光共聚焦试验结果  43-44
  3.3 讨论  44-47
    3.3.1 鸡贫血病毒蛋白之间相互作用  44-45
    3.3.2 酵母双杂交系统  45-46
    3.3.3 互作蛋白的进一步验证  46-47
第四章鸡贫血病毒蛋白相互作用域的定位研究  47-54
  4.1 材料与方法  47-48
    4.1.1 毒株、细胞、质粒  47
    4.1.2 主要试剂  47
    4.1.3 VP1、VP2 和VP3 缺失片段酵母双杂交载体构建  47
    4.1.4 酵母双杂交载体共转化Mav203 感受态及阳性重组子筛选  47-48
  4.2 结果  48-51
    4.2.1 酵母双杂交载体构建  48-50
    4.2.2 截短片段酵母双杂交试验筛选结果  50-51
  4.3 讨论  51-54
    4.3.1 VP1-VP2 蛋白相互作用域定位研究  51-52
    4.3.2 VP2-VP3 蛋白相互作用域定位研究  52-53
    4.3.3 小结  53-54
第五章结论  54-55
参考文献  55-62
致谢  62-63
作者简历  63

鸡贫血病毒蛋白相互作用域定位研究

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