学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

日本血吸虫抱雌沟蛋白相互作用分子的鉴定及两个相关蛋白的研究

作　者: 刘萍萍
导　师: 金亚美
学　校: 中国农业科学院
专　业: 预防兽医学
关键词: 日本血吸虫抱雌沟蛋白酵母双杂交 UDP-葡萄糖表异构酶 Sj34.9基因基因芯片
分类号: S852.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 41次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

血吸虫病是一种分布广泛、危害严重的人畜共患病。目前可以通过药物对感染血吸虫病的个体进行治疗,但是药物治疗不能很好地解决重复感染的问题,也不能有效的预防血吸虫病的发生,所以血吸虫病疫苗的研发显得尤为重要。在血吸虫生长发育过程中雌雄虫合抱尤为关键,血吸虫抱雌沟蛋白是一种可在雌雄虫合抱过程中进行传递并影响雌雄虫合抱的物质。因此,血吸虫抱雌沟蛋白及与其相互作用蛋白的研究对血吸虫生长发育机制的探索及新疫苗的开发具有重要意义。本论文研究工作首先分析了日本血吸虫抱雌沟蛋白功能,然后在本实验室前期利用酵母双杂交技术筛选出多个与日本血吸虫抱雌沟蛋白相互作用阳性克隆的基础上,通过回复杂交实验验证了部分克隆与抱雌沟蛋白间的相互作用,并从中挑选两个基因进行了进一步的研究。论文具体研究工作如下:一、抱雌沟蛋白功能分析及其相互作用蛋白的鉴定利用RNAi和表达谱芯片技术对抱雌沟蛋白功能进行分析,结果显示抱雌沟蛋白可能是一种细胞粘附蛋白,对血吸虫的生长发育及代谢等生物学进程产生重要影响。另外,本实验室前期研究成功构建了18日龄日本血吸虫酵母双杂交cDNA预杂交文库,并利用该技术筛选到与日本血吸虫抱雌沟蛋白相互作用的383个阳性克隆,对序列分析整合后得到45条不同的基因序列。为了排除假阳性,对筛选到的基因进行了酵母体系相互作用验证,结果得到16个与抱雌沟蛋白相互作用的基因,并排除了4个假阳性克隆,相互作用分子中12个为已在GenBank登陆的基因,另外4个为未知基因。二、SjGALE基因的研究首次克隆并表达了SjGALE基因,利用real-time RT-PCR和Western blot考查了该基因在日本血吸虫不同时期的表达情况,结果显示该基因在日本血吸虫的各个时期均有表达,23d成虫体内表达水平最高。免疫组化实验表明该蛋白主要分布于日本血吸虫体被,少量存在于虫体内部组织。为了考查SjGALE的免疫保护效果,利用rSjGALE免疫小鼠后进行攻击感染,结果减虫率和减卵率分别为34%和49%,每只雌虫对肝脏虫卵负荷贡献率降低63%,并且产生了高水平的特异性抗体。IgG抗体亚型分析发现,rSjGALE免疫小鼠后的30-90天内IgG1/IgG2a的数值逐渐降低,说明rSjGALE免疫小鼠后引起Th1型免疫反应。进一步的细胞因子实验分析发现,免疫小鼠的脾细胞经rSjGALE蛋白刺激后IFN-γ,TNF-α和IL-10细胞因子含量较对照组显著升高,IL-4的水平没有明显变化,进一步证实rSjGALE介导了Th1保护性免疫反应。三、日本血吸虫新基因Sj34.9的研究Sj34.9是经验证与日本血吸虫抱雌沟蛋白具有相互作用的分子,且该分子在之前的工作中从未被报道。为深入研究该分子的生物学功能,本研究利用酵母双杂交所得该阳性克隆的已知部分序列,利用RACE技术扩增得到其全长cDNA。其完整cDNA序列1514 bp,含有完整的ORF 966 bp,编码321个氨基酸,理论分子量为34.9 kDa,等电点为9.38。经查询表明该基因为日本血吸虫新基因,将其cDNA序列上传GenBank,命名为Sj34.9,登陆号为:JF907494。利用Real-time PCR分析了Sj34.9基因在血吸虫不同时期的表达情况,结果显示该基因在血吸虫各个时期几乎稳定表达,且雌虫体内该基因的转录水平高于雄虫。利用rSj34.9蛋白免疫小鼠后攻击感染日本血吸虫尾蚴,通过虫卵数的统计考查该重组蛋白的免疫保护作用,结果发现rSj34.9蛋白不具有减虫作用,减卵率为28.9%。利用RNAi技术成功对Sj34.9基因在血吸虫体内的表达进行了干扰,利用血吸虫的寡聚核苷酸表达谱芯片分析了Sj34.9基因表达沉默后血吸虫基因的表达情况。结果显示,RNAi组与对照组相比,显著差异表达的基因共378个,其中上调基因202个,下调基因176个;通路分析显示,差异基因主要与物质代谢,信号转导及信号分子间相互作用有关;基因本体论(GO)分类结果显示,多数基因与分子间结合,膜的构成,细胞过程和机体的生长发育及代谢相关。因而推测Sj34.9基因可能对日本血吸虫的形成、生长、发育、调节、代谢等有重要作用。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-14
第一章前言  14-21
  1.1 血吸虫概述  14-18
    1.1.1 血吸虫生活史  14-15
    1.1.2 血吸虫疫苗研究进展  15-17
    1.1.3 日本血吸虫抱雌沟蛋白  17-18
  1.2 分子生物学技术在寄生虫研究工作中的应用  18-21
    1.2.1 酵母双杂交技术  18
    1.2.2 RNA 干扰技术  18-19
    1.2.3 基因表达谱芯片技术  19-21
第二章日本血吸虫抱雌沟蛋白功能分析及其相互作用分子的鉴定  21-33
  2.1 引言  21
  2.2 材料与方法  21-26
    2.2.1 实验试剂  21
    2.2.2 实验仪器  21-22
    2.2.3 实验方法  22-26
  2.3 实验结果  26-31
  2.4 讨论  31-33
第三章日本血吸虫UDP-葡萄糖表异构酶功能研究  33-53
  3.1 引言  33
  3.2 实验材料  33-34
    3.2.1 实验动物  33
    3.2.2 实验仪器  33-34
    3.2.3 实验试剂  34
  3.3 实验方法  34-40
    3.3.1 实验材料准备  34-35
    3.3.2 重组质粒的构建  35-36
    3.3.3 生物信息学分析  36-37
    3.3.4 重组蛋白表达  37-38
    3.3.5 重组蛋白的抗原性分析  38
    3.3.6 SjGALE 基因在血吸虫不同时期的转录情况  38-39
    3.3.7 SjGALE 蛋白在血吸虫不同时期的表达情况  39
    3.3.8 SjGALE 在血吸虫虫体的定位  39
    3.3.9 小鼠的免疫保护性实验  39-40
    3.3.10 细胞因子分析  40
  3.4 实验结果  40-50
    3.4.1 SjGALE 基因克隆和生物信息学分析  40-42
    3.4.2 SjGALE 重组蛋白表达及抗原性分析  42-45
    3.4.3 小鼠抗rSjGALE 多抗特异性检测  45
    3.4.4 SjGALE 在血吸虫不同时期表达差异分析  45-47
    3.4.5 SjGALE 在日本血吸虫体内的分布  47-48
    3.4.6 rSjGALE 免疫小鼠后特异性抗体水平的消长  48-49
    3.4.7 rSjGALE 免疫小鼠后细胞因子变化  49-50
    3.4.8 rSjGALE 对小鼠的免疫保护效果分析  50
  3.5 讨论  50-53
第四章日本血吸虫Sj34.9 基因的功能预测及研究  53-71
  4.1 引言  53
  4.2 实验材料  53-54
    4.2.1 实验动物  53
    4.2.2 实验仪器  53
    4.2.3 实验试剂  53-54
  4.3 实验方法  54-58
    4.3.1 基因的cDNA 全长克隆  54-55
    4.3.2 重组蛋白的表达纯化  55
    4.3.3 Real-time PCR 检测基因的转录情况  55-56
    4.3.4 小鼠免疫保护实验  56
    4.3.5 RNAi 和基因表达谱预测基因功能  56-58
  4.4 实验结果  58-69
    4.4.1 Sj34.9 全长cDNA 的获得及序列的生物信息学分析  58-60
    4.4.2 rSj34.9 的表达及表达产物的抗原性分析  60-61
    4.4.3 Sj34.9 基因在日本血吸虫不同时期的转录水平分析  61-62
    4.4.4 rSj34.9 免疫小鼠后特异性抗体水平的消长  62-63
    4.4.5 rSj34.9 免疫保护效果分析  63
    4.4.6 Sj34.9 基因功能预测  63-69
  4.5 讨论  69-71
第五章结论  71-72
参考文献  72-79
致谢  79-80
作者简介  80

日本血吸虫抱雌沟蛋白相互作用分子的鉴定及两个相关蛋白的研究

内容摘要

全文目录

相似论文