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禽流感病毒基质蛋白M1与宿主细胞相互作用的初步研究

作　者: 张吉贵
导　师: 李郁；杨志新
学　校: 安徽农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 基质蛋白M1 SPR/BIA Myosin-6蛋白 RAS蛋白酵母双杂交
分类号: S855.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

禽流感病毒基质蛋白M1是包围在病毒核心外的一层膜结构,介于核蛋白与脂质双层膜之间,与组成脂质双层膜的类脂紧密结合,在维持病毒形状与完整性上起重要作用。M1蛋白参与病毒复制过程多个环节,具有调控病毒的转录和被感染细胞的细胞核、细胞浆之间的物质运输作用,以及参与病毒的出芽过程,是流感病毒的主要成分之一。为了探明禽流感病毒基质蛋白M1在病毒复制过程中发挥的作用,本研究运用两种方法寻找宿主细胞中与禽流感病毒基质蛋白相互作用的靶蛋白,并验证这一相互作用,开发基于宿主细胞基因靶点的抗病毒药物。首先,克隆表达了禽流感基质蛋白M1,利用Ni+柱亲和层析对表达的蛋白进行纯化,获得较高纯度的可溶性基质蛋白M1(薄层扫描确定蛋白纯度达86.4%),结合SPR/BIA技术捕获BHK-21细胞裂解液中与基质蛋白M1相互作用的细胞蛋白,并进行质谱分析。结果发现了一种能与禽流感基质蛋白M1相互作用的Myosin-6蛋白(肌球蛋白重链6)。其次,利用酵母双杂交技术筛选人肺cDNA文库中与禽流感病毒基质蛋白M1相互作用基因,通过序列比对及构建全长cDNA返回酵母中验证,剔除假阳性后,最终获得能与M1蛋白相互作用蛋白丛生蛋白(Clusterin)、RAS蛋白、真核转录起始因子5B (EIF5B,Eukaryotic Translation Initiation Factor 5B)、和假想蛋白。最后,选择在细胞信号通路中起重要作用的RAS蛋白为靶标,运用免疫共沉淀技术、细胞共定位技术、双分子荧光技术(BiFC)分别从体外和体内两个方面对M1和RAS蛋白进行了相互作用验证,结果进一步表明两者具有相互作用。总之,本研究首次采用SPR/BIA捕获技术,发现了一种与禽流感病毒基质蛋白M1在细胞外相互作用的Myosin-6蛋白(肌球蛋白重链6)。M1与Myosin-6相互作用可能是抑制了肌球蛋白聚合体的形成,从而影响其生物学功能的发挥,导致直接参与动物肌肉收缩、心脏调节、细胞器运动和信号传导等多种生物学功能的损失。利用酵母双杂交技术获得了四种能和M1蛋白相互作用蛋白,并且验证了M1蛋白与参与信号通路传导的RAS蛋白相互作用。两种方法研究结果为探明M1蛋白参与的禽流感病毒致病机制及抗病毒药物靶标的筛选研究奠定了基础。

禽流感病毒基质蛋白M1与宿主细胞相互作用的初步研究

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