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中国大鲵Sox2和Sox19基因cDNA全长克隆及其组织表达分析

作　者: 何青
导　师: 王勤
学　校: 四川农业大学
专　业: 动物学
关键词: 中国大鲵 Sox2基因 Sox19基因 RT-PCR 荧光定量
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


中国大鲵是地球上生存至今体形最大的两栖动物,是我国独有的稀有物种,已经被列入国家二级保护动物名录中,还被列入CITES公约附录Ⅰ中。中国大鲵在药用、科研、食用、观赏等方面具有重要的开发和研究价值。Sox基因家族是参与个体发育与分化的基因家族,是进化过程中高度保守的基因家族。对Sox基因家族进行研究可以揭示动物性别决定与分化的分子机制、胚胎发育的调控及多种组织器官发生发育过程的调控机制,也可以为一些疾病的诊断和治疗提供分子依据。本实验对中国大鲵Sox2和Sox19基因进行克隆,对其生物学特性进行初步分析,并研究其组织表达情况,为后续的进一步了解中国大鲵Sox2和Sox19基因的结构和功能打下基础,也为用分子生物学方法揭示中国大鲵系统进化、性别决定与分化的分子机制和胚胎发育的调控等打下基础。本论文利用RACE技术,扩增得到了中国大鲵Sox2基因的cDNA全长,全长为2233bp,开放阅读框共963bp,编码320个氨基酸。对中国大鲵Sox2基因的cDNA全长在NCBI上的BLAST在线分析结果表明：其与红腹蝾螈(Cynops pyrrhogaster)和东美螈(Notophthalmus viridescens)的相似度较高分别为89%和88%,与非洲爪蟾(Xenopus laevis)、小鼠(Mus musculus)、人(Homo sapiens)、马(Equus caballus)、猫(Felis catus)、水牛(Bubalus bubalis)、原鸡(Gallus gallus)的相似度在76%-82%之间,与鱼类的相似度较低在20%-40%之间。将Sox2基因所编码的蛋白质用相同方法进行分析,结果显示其与红腹蝾螈I(Cynops pyrrhogaster)相似度最高为92%,与小鼠(Mus musculus)、非洲爪蟾(Xenopus laevis)、大西洋鲑(Salmo salar)、黄腊鲹(Trachinotus blochii)、人(Homo sapiens)、马(Equus caballus)、原鸡(Gallus gallus)等物种的相似度在69%-80之间。本论文还选取不同物种Sox2基因蛋白质序列,基于本研究中所克隆中国大鲵Sox2基因的蛋白质序列,利用MEGA5.0软件,采用邻接法(Neighbor-joining method)重复10000次构建系统发育树,结果显示：中国大鲵与东美蝾和红腹蝾螈聚成一支；鱼类自成一大支；非洲爪蟾和热带爪蟾与哺乳类和鸟类共在一个大支,但是处于不同的分支。表明其与东美蝾和红腹蝾螈的进化关系更为接近,基本符合物种进化的历程。本论文利用RACE技术,扩增得到了中国大鲵Sox19基因的cDNA全长,全长为1290bp,开放阅读框共858bp,编码285个氨基酸。中国大鲵Sox19基因的cDNA全长在NCBI上的BLAST在线分析结果表明,其与红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)相似度为85%,与比目鱼(Hippoglossus)相似度为87%；用DNAMAN与小家鼠(M.musculus)进行比对相似度为8%。将中国大鲵Sox19基因所编码的蛋白质用相同方法进行分析,结果显示其与红鳍东方纯(Takifugu rubripes)相似度为55%,与斑马鱼(Danio rerio)相似度为58%,与舌齿鲈(Dicentrarchus labrax)相似度为64%：与小家鼠(M.musculus)相似度为12%。分析结果显示中国大鲵与其他物种的Sox19基因相似度比较低,且蛋白质序列的相似度并没有高于核苷酸序列的相似度,但是,通过比对发现Sox19基因的HMG盒在各物种之间还是很保守的。选取不同物种Sox19基因蛋白质序列,基于本研究中所克隆中国大鲵Sox19基因的蛋白质序列,利用MEGA5.0软件,采用邻接法重复10000次构建系统发育树,结果显示,中国大鲵单独聚成一支；鱼类自成一大支；小家鼠单独成一支。分析结果得知：中国大鲵与鱼类的进化关系相对哺乳类更为接近,基本符合物种进化的历程。本论文还基于中国大鲵Sox2和Sox19基因的cDNA序列,对中国大鲵的心脏、肾脏、卵巢和肠道组织做了表达谱分析。结果表明,中国大鲵Sox2基因在卵巢中的表达量最高,肾脏中次之,在肠道中表达极低；中国大鲵Sox19基因在心脏中的表达量最高,卵巢中次之,在肾脏和肠道中的表达量相近,在肾脏中的表达量略高于肠道。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-11
第一章 文献综述  11-22
  1 大鲵的研究进展  11-17
    1.1 大鲵的形态特征、分类与分布  11-12
      1.1.1 大鲵的形态特征  11-12
      1.1.2 大鲵的分类与分布  12
    1.2 大鲵遗传方面的研究  12-13
    1.3 大鲵酶学方面的研究  13-14
    1.4 大鲵疾病的研究  14-15
    1.5 大鲵繁殖的研究  15-17
    1.6 大鲵Sox基因的研究  17
  2 Sox基因家族的研究进展  17-21
    2.1 SRY基因的发现  17-18
    2.2 Sox基因的由来  18
    2.3 Sox基因的特点、功能和分类  18-20
      2.3.1 Sox基因的特点  18-19
      2.3.2 Sox基因的功能和分类  19-20
    2.4 Sox2和Sox19基因研究进展  20-21
  3 选题目的及意义  21-22
第二章 中国大鲵Sox2、Sox19基因的克隆及序列分析  22-62
  1 材料和方法  22-34
    1.1 材料  22-23
      1.1.1 动物材料和菌株  22
      1.1.2 主要药品和试剂  22
      1.1.3 主要溶液  22
      1.1.4 培养基  22-23
      1.1.5 主要仪器  23
    1.2 方法  23-33
      1.2.1 引物设计  23-24
      1.2.2 动物材料采集及处理  24-25
      1.2.3 RNA实验环境的清洁  25
      1.2.4 中国大鲵卵巢总RNA的提取  25-26
      1.2.5 中国大鲵卵巢总RNA第一链cDNA的合成  26-28
        1.2.5.1 普通RT-PCR模板的制备  26-27
        1.2.5.2 3'-RACE模板的制备  27
        1.2.5.3 5'-RACE模板的制备  27-28
      1.2.6 保守片段克隆的PCR反应  28-29
        1.2.6.1 扩增中国大鲵Sox2基因保守片段的PCR反应  28
        1.2.6.2 扩增中国大鲵Sox19基因保守片段的PCR反应  28-29
      1.2.7 3'端cDNA的克隆  29-30
        1.2.7.1 中国大鲵Sox2基因3'-RACE  29
        1.2.7.2 中国大鲵Sox19基因3'-RACE  29-30
      1.2.8 5'端cDNA的克隆  30-31
        1.2.8.1 中国大鲵Sox2基因5'-RACE  30-31
        1.2.8.2 中国大鲵Sox19基因5'-RACE  31
      1.2.9 ORF克隆的PCR反应  31-32
        1.2.9.1 扩增中国大鲵Sox2基因ORF的PCR反应  31
        1.2.9.2 扩增中国大鲵Sox19基因ORF的PCR反应  31-32
      1.2.10 PCR扩增产物的回收、TA克隆及测序  32-33
        1.2.10.1 PCR产物的回收  32-33
        1.2.10.2 回收产物TA克隆及测序  33
    1.3 序列分析  33-34
  2 结果与分析  34-59
    2.1 中国大鲵卵巢总RNA的提取  34
    2.2 保守片段扩增  34-35
      2.2.1 中国大鲵Sox2基因保守片段扩增  34-35
      2.2.2 中国大鲵Sox19基因保守片段扩增  35
    2.3 3'端cDNA的克隆  35-36
      2.3.1 中国大鲵Sox2基因3'-RACE  35-36
      2.3.2 中国大鲵Sox19基因3'-RACE  36
    2.4 5'端cDNA的克隆  36-37
      2.4.1 中国大鲵Sox2基因5'-RACE  36-37
      2.4.2 中国大鲵Sox19基因5'-RACE  37
    2.5 ORF克隆的PCR反应  37-38
      2.5.1 扩增中国大鲵Sox2基因ORF的PCR反应  37-38
      2.5.2 扩增中国大鲵Sox19基因ORF的PCR反应  38
    2.6 中国大鲵Sox2基因序列分析  38-49
      2.6.1 中国大鲵Sox2基因核苷酸序列分析  38-41
      2.6.2 中国大鲵Sox2基因相似度分析  41
      2.6.3 Sox2蛋白质序列构建系统进化树和序列比对  41-44
        2.6.3.1 Sox2蛋白质序列构建系统进化树  42
        2.6.3.2 Sox2蛋白质序列比对  42-44
      2.6.4 中国大鲵Sox2蛋白质生化特征分析和结构预测  44-49
        2.6.4.1 中国大鲵Sox2蛋白质基本信息  44
        6.2.4.2 中国大鲵Sox2蛋白质序列分析  44-49
    2.7 中国大鲵Sox19基因序列分析  49-59
      2.7.1 中国大鲵Sox19基因cDNA序列分析  49-51
      2.7.2 中国大鲵Sox19基因相似度分析  51-52
      2.7.3 Sox19蛋白质序列构建系统进化树和序列比对  52-53
        2.7.3.1 Sox19蛋白质序列构建系统进化树  52-53
        2.7.3.2 Sox19蛋白质序列比对  53
      2.7.4 中国大鲵Sox19蛋白质生化特征分析和结构预测  53-59
        2.7.4.1 中国大鲵Sox19蛋白质基本信息  53-54
        2.7.4.2 中国大鲵Sox19蛋白质序列分析  54-59
  3 讨论  59-62
    3.1 中国大鲵Sox2和Sox19基因cDNA全长的克隆  59-60
    3.2 Sox2和Sox19基因HMG-box保守性分析  60-62
第三章 中国大鲵Sox2和Sox19基因的组织表达谱分析  62-71
  1 材料和方法  62-66
    1.1 材料  62-63
      1.1.1 动物材料  62
      1.1.2 主要药品和试剂  62
      1.1.3 主要溶液  62
      1.1.4 主要仪器  62-63
    1.2 方法  63-66
      1.2.1 引物设计  63
      1.2.2 动物材料采集及处理  63
      1.2.3 RNA实验环境的清洁  63-64
      1.2.4 中国大鲵心脏、肾脏和肠道总RNA的提取  64-65
      1.2.5 中国大鲵心脏、肾脏和肠道总RNA第一链cDNA的合成  65
      1.2.6 实时荧光定量PCR  65-66
      1.2.7 定量方法  66
      1.2.8 数据分析  66
  2 结果与分析  66-69
    2.1 中国大鲵心脏、肾脏和肠道总RNA的提取  66-67
    2.2 各个组织表达量分析  67-69
      2.2.1 实时荧光定量PCR  67-68
      2.2.2 中国大鲵Sox2基因在心脏、肾脏、卵巢和肠道的相对表达  68-69
      2.2.3 中国大鲵Sox19基因在心脏、肾脏、卵巢和肠道的相对表达  69
  3 讨论  69-71
    3.1 实时荧光定量PCR  69-70
    3.2 中国大鲵Sox2和Sox19基因在各个组织中的表达分析  70-71
结论  71-72
参考文献  72-77
致谢  77

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产基础科学 > 水产生物学 > 水产动物学
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