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亚急性瘤胃酸中毒（SARA）对山羊肝脏免疫机能的影响

作　者: 王绍庆
导　师: 倪迎冬
学　校: 南京农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: SARA LPS TLR4 细胞因子 急性期蛋白 肝脏 山羊
分类号: S858.27
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


反刍动物亚急性瘤胃酸中毒(Subacute ruminal acidosis, SARA)是一种多发性代谢性疾病,常见于现代化的奶牛养殖场,该病易引起瘤胃内微生物区系的紊乱、蹄叶炎、肝脏脓肿及乳成分结构改变,严重影响奶牛健康和生产性能。目前关于SARA的报道大多集中于诊断防治及生化指标的检测上,但是关于SARA对肝脏免疫机能影响的研究甚少。肝脏免疫机能的改变可能会导致肝脏物质代谢的紊乱,从而影响乳成分前体物的重分配,引起乳品质的下降。本文旨在研究高精料诱导SARA时瘤胃异常代谢产物脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)含量的变化,以及对肝脏免疫机能的影响。1. SARA对干乳期山羊肝脏免疫和下丘脑食欲调节因子的影响实验选用12只本地干乳期山羊,随机分为对照组和SARA组,分别饲喂精粗比为40：60和60：40的饲料,实验期21天。实验结束时采集瘤胃液、血液、肝脏等样品,pH计迅速测定瘤胃液pH值,并测定瘤胃液中乳酸含量；采用酶联免疫吸附方法(ELISA)检测血液中细胞因子TNF-a (Tumor necrosis factor-a, TNF-a), IL-6(Interleukin-6, IL-6)、IL-1β (Interleukin-1β, IL-1β)和急性期蛋白血清淀粉样蛋白A (Serum amyloid A, SAA)、触珠蛋白(haptoglobin, HP)、脂多糖结合蛋白(Lipopolysaccharide-bindin protein)的浓度；Real-time PCR和Western blot方法从mRNA和蛋白水平检测了TLR4通路相关基因及下游细胞因子在肝脏、下丘脑、海马中的表达水平,并检测了肝脏中急性期蛋白和下丘脑摄食调节功能相关基因的表达。结果显示：(1)精粗比60：40日粮饲喂2周后成功建立山羊SARA模型(SARA组),采食后瘤胃液pH值低于5.8且持续时间约3h,而精粗比为4：6组(对照组)山羊瘤胃液pH均高于6.0；(2)乳酸在采食后2-4小时之间下降,6-8小时逐渐增加,但两组间无显著差异(P>0.05)。(3)SARA组山羊血浆中IL-1β、HP含量显著高于对照组(P<0.05),血浆TNF-a水平相对于对照组有升高趋势(0.05<P<0.1)。(4)肝脏中TLR4(Toll-like receptor4, Toll样受体4)及细胞因子表达没有显著差异(P>0.05),但急性期蛋白SAA和HP mRNA显著上调(P<0.05)。(5)SARA组下丘脑TLR4、髓样分化因子(Myeloid differentiation primary response gene88, MyD88)及TNF-a表达上调(P<0.05),刺鼠相关蛋白(Agouti-related protein, AgRP)基因表达显著下调(P<0.05),神经肽Y (Neuropeptide Y, NPY)基因表达有下调的趋势(0.05<P<0.1),但SARA组山羊下丘脑中前阿片黑素细胞皮质激素(Pro-opiomelanocortin, POMC)和促黑激素受体4(Melanocortin receptor4, MCR4)的基因表达均无显著性变化(P>0.05)。2. SARA对泌乳中期山羊泌乳和肝脏免疫机能的影响(1)短期试验：选用7只处于泌乳中期的本地山羊,手术安装永久性瘤胃瘘管,随机分为两组,分别饲喂精粗比为40：60和60：40的饲料,2×2拉丁方设计,实验分两期,每期14d。采集瘤胃液并测定pH和乳酸含量；检测血液中LPS和细胞因子TNF-a、IL-1β、IL-6的水平；检测肝脏TLR4和细胞因子的基因表达。结果：精粗比60：40日粮饲喂泌乳期山羊2周后成功诱导SARA (SARA组),采食后瘤胃液pH值低于5.8且持续时间约6h, SARA组山羊瘤胃液中乳酸和LPS含量都显著高于对照组(P<0.05)。SARA对血浆中TNF-a和IL-1p含量有显著影响(P<0.05),但不影响肝脏TLR4、TNF-a、IL-1β mRNA的表达(P>0.05)。以上结果提示：SARA导致瘤胃中乳酸的积累以及瘤胃异常代谢产物LPS的增加,但泌乳山羊经历短期SARA时肝脏对LPS不产生应答反应,不改变TLR4及下游信号分子的转录水平。(2)长期试验：选择8只泌乳中期的萨能奶山羊,手术安装永久性瘤胃瘘管,随机分为对照组(n=4)和SARA组(n=4),分别饲喂精粗比为40：60和60：40的饲料,实验期为9周。每天记录山羊的产奶量和健康状况；每两周测一次乳成分含量和瘤胃pH值；采样后测定血中细胞因子TNF-a、IL-6及急性期蛋白SAA、LBP、HP的含量；检测肝脏中TLR4、TLR2、MyD88、CD14,细胞因子TNF-a、IL-1β,急性期蛋白SAA、C-反应蛋白(C-reaction protein, CRP)、LBP、HP的基因表达；采用western blot方法检测肝脏组织中TLR4和p65的蛋白表达水平。结果显示：(1)高精料(60%)饲喂山羊2周后山羊出现SARA现象,饲喂4周后由于对饲料的适应和瘤胃缓冲能力的增加瘤胃pH增加,但仍显著低于对照组山羊(P<0.05)。与对照组山羊相比,SARA山羊采食前瘤胃液中乳酸浓度有升高趋势(0.05<P<0.1)；LPS浓度无显著变化(P>0.05)。(2)SARA组奶产量一直极显著高于对照组(P<0.01)；第6-9周乳蛋白和乳脂水平都显著低于对照组(P<0.05),第2周乳脂水平极显著低于对照组(P<0.01)；第8周乳糖水平显著高于对照组(P<0.05),乳中体细胞数显著高于对照组。(3)与对照组相比,SARA组山羊血浆TNF-a水平有显著影响(P<0.05),血浆IL-6浓度有升高趋势(0.05<P<0.1)；血浆急性期蛋白SAA显著升高(P<0.05),HP有升高趋势(0.05<P<0.1),LBP水平没有显著差异(P>0.05)。(4)与对照组相比,SARA组山羊肝脏中TLR4mRNA水平显著上调(P<0.05),蛋白表达也有升高迹象,p65表达有。TLR2、CD14、MyD88和TNF-α表达没有显著差异(P>0.05),细胞因子IL-1p显著上调(P<0.05);急性期蛋白SAA、CRP、HP表达显著增加(P<0.05),与血浆中的蛋白含量基本一致；但两组山羊肝脏中LBP基因表达无显著差异(P>0.05)。

全文目录


摘要  7-10
ABSTRACT  10-13
本文部分缩写的中英文对照  13-14
引言  14-15
第一篇 文献综述  15-33
  第一章 亚急性瘤胃酸中毒及急性期蛋白研究进展  15-27
    1 亚急性瘤胃酸中毒研究进展  15-20
      1.1 亚急性瘤胃酸中毒的判定  15-16
      1.2 亚急性瘤胃酸中毒的发病机制和流行病学  16-17
      1.3 亚急性瘤胃酸中毒的危害  17-18
      1.4 亚急性瘤胃酸中毒的诊断与防治  18-20
    2 急性期蛋白研究进展  20-27
      2.1 急性期蛋白及其分类  20-22
      2.2 急性期蛋白的合成和调控  22-23
      2.3 急性期蛋白的生物学功能  23-24
      2.4 急性期蛋白的检测方法  24-25
      2.5 急性期蛋白的诊断价值  25
      2.6 亚急性瘤胃酸中毒对急性期蛋白的影响  25-27
  第二章 脂多糖对机体的影响  27-33
    1 脂多糖概述  27-28
      1.1 脂多糖的结构  27
      1.2 脂多糖的危害  27-28
    2 脂多糖对肝脏免疫等功能的影响  28-30
      2.1 肝细胞的免疫功能  28
      2.2 脂多糖信号通路  28-29
      2.3 脂多糖对肝脏免疫等功能基因表达的影响  29-30
    3 脂多糖对下丘脑的影响  30
    4 亚急性瘤胃酸中毒与LPS  30-33
第二篇 试验研究  33-75
  第三章 SARA对干奶期山羊肝脏免疫及下丘脑食欲调节因子的影响  33-51
    1 材料和方法  33-41
      1.1 试验动物  33
      1.2 试验设计  33-34
      1.3 样品采集处理与分析测定  34-35
      1.4 主要试剂和仪器  35
      1.5 主要溶液  35-36
      1.6 脂多糖的测定  36
      1.7 乳酸的测定  36
      1.8 细胞因子的测定  36
      1.9 急性期蛋白的测定  36-37
      1.10 Real-time PCR检测山羊肝脏免疫相关因子和下丘脑中食欲调节相关基因表达  37-39
      1.11 Western blot方法检测肝脏中TLR4蛋白表达水平  39-40
      1.12 数据统计与分析  40-41
    2 结果与分析  41-48
      2.1 SARA对瘤胃液pH的影响  41
      2.2 SARA对瘤胃液乳酸浓度的影响  41-42
      2.3 SARA对血浆LPS的影响  42
      2.4 SARA对血浆细胞因子TNF-α和IL-1β的影响  42-43
      2.5 SARA对血浆急性期蛋白HP、SAA的影响  43-45
      2.6 SARA对肝脏TLR4通路及下游调控因子mRNA表达的影响  45
      2.7 SARA对肝脏TLR4蛋白表达的影响  45-46
      2.8 SARA对下丘脑和海马TLR4及相关细胞因子表达的影响  46-47
      2.9 SARA对下丘脑食欲调节因子基因表达的影响  47-48
    3 讨论  48-51
      3.1 SARA对瘤胃pH和乳酸的影响  48-49
      3.2 SARA对急性期蛋白和血浆中细胞因子的影响  49
      3.3 SARA对下丘脑食欲调节因子的影响  49-51
  第四章 SARA对泌乳中期山羊泌乳及肝脏免疫机能的影响  51-75
    1 材料与方法  51-56
      1.1 试验动物及其饲养  51
      1.2 试验设计  51-53
      1.3 样品采集处理与分析测定  53
      1.4 主要试剂和仪器  53-54
      1.5 主要溶液  54
      1.6 血浆中细胞因子含量测定  54
      1.7 血浆急性期蛋白含量测定  54
      1.8 Real-time PCR检测山羊肝脏中相关基因表达  54-56
      1.9 Western blot方法检测肝脏中TLR4蛋白表达水平  56
      1.10 数据统计与分析  56
    2. 结果与分析  56-70
      2.1 短期试验  56-61
      2.2 长期试验  61-70
    3 讨论  70-75
      3.1 SARA对瘤胃中乳酸和pH的影响  70-71
      3.2 SARA对脂多糖的影响  71
      3.3 SARA对急性期蛋白的影响  71-72
      3.4 SARA对乳产量和乳成分的影响  72-75
全文结论  75-77
参考文献  77-89
致谢  89-91
硕士学位期间发表论文情况  91

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家畜 > 山羊
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