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山羊白细胞介素-1β与白细胞介素-6的克隆表达及生物学活性研究

作 者: 李学钊
导 师: 李祥瑞
学 校: 南京农业大学
专 业: 预防兽医学
关键词: 山羊 IL-1β IL-6 生物学活性
分类号: S827
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
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内容摘要


白细胞介素-1β(IL-1β)是一种在动物机体的炎症发生中起重要调节作用的细胞因子,主要由单核/巨噬细胞合成和分泌,通过诱导淋巴细胞的分化和增值提高机体细胞免疫应答。IL-1β还可以提高疫苗的免疫效果,作为潜在的免疫佐剂。将IL-1β作为疫苗佐剂已经在绵羊、猪、牛和鱼等动物中广泛研究或使用。白细胞介素-6(IL-6)是一种多功效的细胞因子,其在调节免疫应答、急性期反应、造血功能以及炎症反应中发挥着重要的作用。机体许多细胞都可以合成和分泌IL-6,并且作用于B细胞、T细胞、肝实质细胞、骨髓造血干细胞以及中枢神经系统中的某些细胞。IL-6和IL-1、TNF-α共同作用是机体急性期反应发生的强有力的诱发因子。本研究根据山羊IL-1β(GenBank登录号D63351)和山羊IL-6(GenBank登录号D86569),设计并合成特异性引物,分别以本实验室保存的山羊IL-1βcDNA和IL-6 cDNA为模板,扩增了山羊IL-1β和IL-6的全序列和成熟肽序列基因。结果显示,山羊IL-1β开放阅读框(0RF)为801bp,与GenBank中登录的山羊IL-1β基因序列(登录号D63351)相似性为99.4%,编码267个氨基酸。山羊IL-6开放阅读框(ORF)为627bp,切除信号肽后核苷酸片段大小为552bp,与GenBank中登录的山羊IL-6基因序列(登录号D86569)相似性为99.6%,编码184个氨基酸。应用DNA重组技术,将克隆成功的山羊GIL-1β基因和mGIL-6成熟蛋白基因分别与原核表达载体pET-28a(+)和pET-32a(+)连接,构建了pET-28a(+)-GIL-1β和pET-32a(+)-mGIL-6原核表达载体。将其转化至E.coli BL21(DE3)宿主菌中诱导表达,表达产物超声裂解后经SDS-PAGE分析,GIL-1β融合蛋白大小为33.07KDa,mGIL-6融合蛋白大小为42.24KDa。GIL-1β融合蛋白主要以包涵体形式存在,mGIL-6融合蛋白则以上清和包涵体两种形式存在。用His镍柱将其成功纯化后,并对溶解在尿素中的GIL-1β包涵体采用透析复性法将其复性。为了检测GIL-1β融合蛋白和mGIL-6融合蛋白的生物学活性,本实验通过GIL-1β融合蛋白协同伴刀豆蛋白A(ConA)促C57BL品系小鼠胸腺细胞增值实验检测了GIL-1β融合蛋白的活性,结果显示重组山羊IL-1β具有明显促C57BL品系小鼠胸腺细胞增值效应。通过mGIL-6融合蛋白对伴刀豆蛋白A(ConA)诱导活化的山羊外周血淋巴细胞的增值实验检测了mGIL-6融合蛋白的活性,结果显示重组山羊IL-6具有明显促山羊外周血淋巴细胞增值效应。

全文目录


摘要  6-8ABSTRACT  8-10前言  10-11上篇:文献综述  11-29  第一章 白细胞介素-1B研究进展  11-19    1.1 IL-1B分子的来源及功能  11-12    1.2 IL-1B的结构  12-13    1.3 IL-1B受体结构及信号传导  13-14    1.4 IL-1B生物学活性检测方法  14-16    参考文献  16-19  第二章 白细胞介素-6研究进展  19-29    2.1 IL-6分子的来源及功能  19-22      2.1.1 IL-6的免疫应答调节活性  20-21      2.1.2 IL-6的造血作用  21      2.1.3 IL-6与急性期反应  21      2.1.4 IL-6的其它生物学活性  21-22    2.2 IL-6的结构  22-23    2.3 IL-6受体结构及信号传导  23-24    2.4 IL-6生物学活性检测方法  24-26    参考文献  26-29下篇 试验研究  29-59  第三章 山羊IL-1B和IL-6基因的克隆与序列分析  29-39    3.1 材料和方法  29-31      3.1.1 材料  29-30      3.1.2 实验方法  30-31    3.2 结果  31-35      3.2.1 GIL-1β的PCR扩增  31-32      3.2.2 pGIL-6与mGIL-6的PCR扩增  32-33      3.2.3 重组T载体双酶切鉴定结果  33-35      3.2.4 山羊IL-1β和IL-6基因的序列测定及分析  35    3.3 讨论  35-37    参考文献  37-39  第四章 重组山羊IL-1B和IL-6的表达和纯化  39-51    4.1 材料和方法  39-42      4.1.1 材料  39-40      4.1.2 实验方法  40-42    4.2 结果  42-48      4.2.1 GIL-1β和mGIL-6原核表达载体双酶切鉴定  42-43      4.2.2 GIL-18和mGIL-6表达产物的SDS-PAGE分析  43-45      4.2.3 GIL-1β和mGIL-6表达产物在菌体中的分布  45-46      4.2.4 目的蛋白的纯化与复性  46-48    4.3 讨论  48-49    参考文献  49-51  第五章 重组山羊IL-1B和IL-6蛋白的生物学活性分析  51-59    5.1 材料和方法  51-53      5.1.1 材料  51-52      5.1.2 实验方法  52-53    5.2 结果  53-54      5.2.1 GIL-1β融合蛋白协同ConA促小鼠胸腺细胞增值效应  53      5.2.2 mGIL-6融合蛋白对ConA活化的山羊外周血淋巴细胞增值效应  53-54    5.3 讨论  54-57    参考文献  57-59全文总结  59-61致谢  61

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家畜 > 山羊
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