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蛋内注射leptin对肉鸡肝脏胆固醇代谢相关基因及microRNA表达的影响

作　者: 张锐
导　师: 赵茹茜
学　校: 南京农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: leptin microRNA 胆固醇代谢 肝脏 鸡 功能验证
分类号: S831
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


本实验室以往研究表明蛋内注射瘦素(leptin)可显著提高新生雏鸡肝脏和血液中leptin含量,改变新生雏鸡脂代谢模式。本研究旨在探讨蛋内注射leptin对新生雏鸡肝脏脂代谢相关基因及microRNA (miRNA)表达的影响,以揭示蛋内注射leptin对新生雏鸡脂代谢影响的可能机制。1蛋内注射leptin对新生雏鸡肝脏胆固醇代谢相关基因表达的影响本实验将三黄肉鸡种蛋随机分为两组,对照组在蛋清内注射100μL溶剂(PBS),处理组蛋清内注射100μL含0.5μg重组小鼠leptin的PBS。出雏当天(0日龄)采集肝脏组织样品。采用实时荧光RT-PCR检测肝脏胆固醇代谢相关基因mRNA表达,包括固醇类调控元件结合蛋白2(sterol regulator element binding protein 2, SREBP-2)、3-羟-3甲基戊二酸单酰CoA还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase, HMGCR)、胆固醇-7α-羟化酶(cholesterol-7alpha-hydroxylase, CYP7A1)和低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor, LDLR),采用蛋白质印迹(western blot)测定肝脏SREBP-1、SREBP-2、HMGCR和CYP7A1蛋白质含量。结果表明：蛋内注射leptin能显著上调新生雏鸡肝脏SREBP-2、HMGCR和CYP7A1的mRNA表达(P=0.013,0.000,0.011),显著上调SREBP-1和SREBP-2 (P= 0.030,0.000)蛋白质表达,而对LDLR的mRNA表达(P=0.333)及HMGCR和CYP7A1蛋白质表达(P=0.386,0.599)无显著影响。2蛋内注射leptin对新生雏鸡肝脏胆固醇代谢相关microRNA表达的影响运用生物信息学算法TargetScan 5.1 (http://www.targetscan.org/)预测得到以SREBP-1为靶基因的9个miRNA和以HMGCR为靶基因的5个miRNA,其中gga-miR-200b和gga-miR-429同时靶向SREBP-1和HMGCR。采用实时荧光RT-PCR检测肝脏中这12个miRNA表达水平。结果表明：蛋内注射leptin能显著上调新生雏鸡肝脏gga-miR-99a, gga-miR-100, gga-miR-200a, gga-miR-200b和gga-miR-429 (P = 0.024,0.026,0.045,0.033,0.038)等5个miRNA的表达水平。3双荧光素酶报告基因系统对胆固醇代谢相关microRNA进行功能验证为确定差异表达的microRNA对SREBP-1和HMGCR表达的调节作用,本实验采用双荧光素酶报告基因系统对差异表达的miRNA进行了功能验证。首先,用带有酶切位点的引物将SREBP1和HMGCR的3’UTR序列从鸡基因组DNA中扩增出来,然后插入到pGL3-Control萤火虫荧光素酶质粒的Xbal酶切位点处。其次,将双链miRNA前体连接到pSilencer 3.0-H1 siRNA表达质粒上,最后将构建好的3’UTRpGL3-Control萤火虫荧光素酶质粒、pRL-TK海’肾荧光素酶质粒和：niRNA过表达质粒共转染鸡胚成纤维细胞系DF-1,24 h后用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光值。结果表明：在鸡胚成纤维细胞中,gga-miR-100和gga-miR-183过表达可抑制带有SREBP-1的3’UTR片段的荧光素酶报告基因的表达,gga-miR-200b过表达可以抑制带有HMGCR的3’UTR片段的荧光素酶报告基因的表达。

全文目录


摘要  7-9ABSTRACT  9-11缩略语  11-12引言  12-13第一篇 文献综述  13-31  第一章 microRNA生物学功能  13-23    1 miRNA的发现  13    2 miRNA生物合成  13-17      2.1 miRNA基因转录pri-miRNA  15      2.2 pri-miRNA经剪切产生pre-miRNA  15-16      2.3 pre-miRNA由exportin 5转运出核  16      2.4 Dicer剪切pre-miRNA生产miRNA双链  16      2.5 RISC的组装  16-17    3 miRNA的表达调控  17-19      3.1 转录调控  17      3.2 转录后调控  17-19      3.3 miRNA网络中的反馈回路  19    4 miRNA生物学作用机制  19-23      4.1 降解mRNA序列  19-20      4.2 阻断翻译的起始  20      4.3 转运到处理体  20      4.4 激活翻译  20-23  第二章 Leptin对脂代谢相关基因及microRNA表达调控  23-31    1 肝脏脂代谢及其调控  23-24      1.1 甘油三酯的合成  23-24      1.2 胆固醇的合成  24    2 miRNA在脂代谢中的作用  24-28      2.1 miR-122  25-26      2.2 miR-370  26-27      2.3 miR-33基因家族  27-28      2.4 其它microRNA  28    3 Leptin对肝脏胆固醇代谢的调控及MIRNA的参与  28-31      3.1 leptin对胆固醇代谢的调控  28-29      3.2 leptin与miRNA的关联性研究  29      3.3 miRNA与鸡脂代谢  29-31第二篇 试验研究  31-63  第三章 蛋内注射leptin对新生雏鸡肝脏胆固醇代谢相关基因表达的影响  31-43    1 材料与方法  31-36      1.1 试验动物及处理  31-32      1.2 主要试剂和仪器  32      1.3 主要溶液  32-33      1.4 Real time RT-PCR定量测定胆固醇代谢相关基因表达  33-34      1.5 免疫印迹(western blot,WB)检测胆固醇代谢关键点基因蛋白质含量  34-36      1.6 数据分析及统计  36    2 结果与分析  36-40      2.1 胆固醇代谢相关基因的mRNA水平  36-37      2.2 胆固醇代谢相关基因的蛋白质水平  37-39      2.3 胆固醇代谢转录调节因子SREBP-1的mRNA及SREBP-2的mRNA和蛋白质表达  39-40    3 讨论  40-43  第四章 蛋内注射leptin对新生雏鸡肝脏胆固醇代谢相关microRNA表达的影响  43-49    1 材料与方法  43-46      1.1 试验动物及处理  43      1.2 主要试剂和仪器  43      1.3 Real time RT-PCR定量测定胆固醇代谢相关基因表达  43-46      1.4 数据分析及统计  46    2 结果与分析  46-47      2.1 胆固醇代谢相关miRNA表达  46-47    3 讨论  47-49  第五章 胆固醇代谢相关microRNA的功能验证  49-63    1 材料与方法  49-59      1.1 细胞系、菌株及质粒  49      1.2 主要试剂和仪器  49-52      1.3 pGL3 control-3'UTR质粒构建  52-59      1.4 数据分析及统计  59    2 结果与分析  59-61      2.1 pGL3 control-SREBP-1/HMGCR 3'UTR质粒构建  59      2.2 miRNA过表达质粒构建  59-60      2.3 靶向SREBP-1的miRNA功能验证  60-61      2.4 靶向HMGCR的miRNA功能验证  61    3 讨论  61-63结论  63-65参考文献  65-77致谢  77-79攻读学位期间发表的学术论文目录  79

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家禽 > 鸡
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