学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

基于荚膜及外毒素的免疫策略防治金黄色葡萄球菌感染效果研究

作　者: 王林会
导　师: 徐永平
学　校: 大连理工大学
专　业: 生物化工
关键词: 金黄色葡萄球菌 荚膜 毒素 感染 疫苗
分类号: S852.611
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
下　载: 50次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)是一种重要的人畜共患病病原菌,荚膜和外毒素是其重要的致病因子,本研究以这两类抗原为靶点寻找有效的免疫学手段以替代抗生素防治感染性疾病。针对奶牛乳房炎,本课题组前期研究发现,特异性卵黄抗体(IgY)具有显著的治疗作用,但是针对荚膜及外毒素的IgY尚未研究。针对人类金黄色葡萄球菌感染,目前尚无有效的疫苗。而糖工程是生产多糖-蛋白生物结合疫苗的全新技术,通过这一手段可将金黄色葡萄球菌荚膜多糖和外毒素交联制成多价疫苗,并最大程度保护其抗原决定簇。本研究考察了荚膜-毒素生物结合疫苗在人类重要感染疾病模型中的预防作用。(1)针对奶牛乳房炎,本研究采用5型(CP5)、8型(CP8)和336型(无荚膜)金黄色葡萄球菌全菌疫苗免疫蛋鸡后分离纯化获得IgY (IgY-T5, IgY-T8, IgY-T336),纯度达到80%。ELISA检测结果表明,IgY-T5、 IgY-T8及IgY-T336特异性地结合相应血清型的抗原,三者间无交叉反应,而且都不与酸奶发酵所用保加利亚杆菌结合,故对酸奶生产无不良影响。体外抑菌实验表明,在液体培养基中生长8h期间,15mg/ml的IgY-T5和IgY-T8不能抑制T5和T8荚膜金黄色葡萄球菌的生长,而15mg/ml的IgY-T336可显著抑制(4～8h)T5、T8和T336菌的生长,抑制强度约为2个Log单位,提示抑菌作用主要依赖于IgY与表面蛋白而非荚膜的结合。细菌侵袭实验表明,5mg/ml的IgY-T5, IgY-T8, IgY-T336能够分别抑制5,8和336型金黄色葡萄球菌对奶牛乳腺上皮细胞(MAC-T)的侵袭。以上结果表明,针对荚膜的特异性卵黄抗体在奶牛乳房炎的防治中具有潜在应用价值。(2)金黄色葡萄球菌外毒素也是奶牛乳房炎的一个主要致病因子,本研究分离金黄色葡萄球菌V8及RN6390的总外毒素,通过免疫蛋鸡获得特异性抗体(IgY-toxins)乳酸脱氢酶(LDH)释放实验表明,IgY-toxins可有效阻断金黄色葡萄球菌外毒素对MAC-T细胞及嗜中性粒细胞的裂解,此保护作用呈现浓度依赖性。本实验中用表达GFP的336型金黄色葡萄球菌菌株RN6390来评价IgY对金黄色葡萄球菌入侵MAC-T细胞的阻断作用。通过荧光显微镜观察,5mg/ml的IgY-T336可明显阻断RN6390对MAC-T细胞的侵袭,5mg/ml的IgY-T336和0.5mg/ml的IgY-toxins联合使用时能够更好地阻断金黄色葡萄球菌侵袭MAC-T细胞,而且细胞生长形态大大改善。临床型乳房炎实验表明,三种荚膜特异性IgY联合治疗(IgY-T5,IgY-T8及IgY-T336各20mg)5天后,患病奶牛乳液中体细胞计数(SCC)明显降低,使用20mg的IgY-toxins可达到同等效果。如果将三种荚膜特异性IgY(每种20mg)和IgY-toxins (20mg)联合使用两天后,体细胞数就得到显著降低,SCC数降至1～2×104cells/ml,并一直保持到实验的第6天,且最终SCC水平低于抗荚膜或者毒素IgY单独治疗组,疗效与青霉素(100mg)治疗组相当。通过感观评价治疗后第6天奶样发现,所有4个治疗组奶样凝块水平都明显低于对照组,组间无差异。3个IgY治疗组不能显著降低奶样中金黄色葡萄球菌数。结合(1),以上结果提示抗荚膜和毒素特异性IgY联合使用比单独使用更有效,IgY在乳房炎的治疗中应该着眼于中和毒素和抵御金黄色葡萄球菌入侵上皮细胞,而非抑菌作用。(3)针对人类的感染疾病,体外功能性实验表明,荚膜多糖-毒素生物结合疫苗免疫所得抗体αCP5-Epa、 αCP5-Hla、αCP8-Epa能特异性地调理5型和8型金黄色葡萄球菌被嗜中性粒细胞杀伤, αCP5-Hla还可有效中和α-毒素的细胞毒作用。提示,糖工程技术可在大肠杆菌中成功表达具有免疫原性和生物学功能的金黄色葡萄球菌结合疫苗。(4)金黄色葡萄球菌菌血症是临床上很常见的感染,本研究通过小鼠菌血症模型研究发现,主动免疫0.2μg CP5-2μg Epa可有效预防小鼠菌血症及体重下降、肾脏脓肿。被动免疫1mg的α CP5-Epa可有效预防Reynolds、 USA100及USA200所致的小鼠菌血症。主动免疫2(μg CP5-20μg Hla或被动免疫1mg的α CP5-Hla有效预防小鼠菌血症。对于CP8菌株,主动免疫0.2μg CP8-2μg Epa可预防Reynolds (CP8+)所致菌血症,但是对体重下降、肾脏脓肿没有显著的保护作用。被动免疫1mg的α CP8-Epa可显著预防Reynolds (CP8+)引起的小鼠菌血症。提示CP5和CP8疫苗对系统性感染-菌血症的预防切实有效。(5)金黄色葡萄球菌肺炎也是临床上非常严重的感染,致死率很高。本研究通过小鼠模型研究发现,主动免疫2μg CP5-20μg Hla可有效预防由Newman (CP5+)以及两株MRSA菌株LAC(CP-)和ST80(CP8+)所引起的致死性肺炎,同时可有效预防Reynolds(CP5+)所致小鼠菌血症。小鼠免疫CP5-Hla后,利用单克隆抗体将CD4+T细胞和CD8+T细胞剔除,其存活率与不剔除时无显著差异。提示,T细胞在CP5-Hla主动免疫保护过程中不起作用。被动免疫1mg α CP5-Hla可有效预防小鼠的菌血症,而且能够显著延长小鼠在致死性肺炎模型中的存活时间,但是不能提高存活率。分别在攻毒前24h和2h被动免疫1mg的α CP5-Hla可显著预防小鼠死于致死性肺炎。(6)金黄色葡萄球菌也能在医疗器械,如导管上定殖,甚至形成生物被膜,从而导致感染。在导管介导的大鼠心内膜炎模型中,α CP5-Hla不能起到稳定的保护作用,对模型相关的心脏瓣膜赘生物的形成、菌血症水平、体重指数、肾脏细菌水平及存活率只是呈现一定的保护趋势。抗体剂量需要进一步摸索。以上结果表明,金黄色葡萄球菌荚膜多糖和外毒素是免疫防治策略很好的靶点。因此,针对这两个靶点的IgY可有效治疗临床型金黄色葡萄球菌奶牛乳房炎。利用糖工程方法生产的荚膜-毒素生物结合疫苗可有效预防小鼠菌血症(系统性感染)、肺炎(局部性感染),而且对心内膜炎(外科介入相关感染)有一定的保护趋势。针对金黄色葡萄球菌荚膜及外毒素的免疫策略在人畜共患病的防治中具有很好的应用潜力。

全文目录


摘要  4-7
Abstract  7-10
缩略词表  10-17
引言  17-19
1 绪论  19-46
  1.1 金黄色葡萄球菌荚膜  19-23
    1.1.1 金黄色葡萄球菌简介  19
    1.1.2 5型和8型荚膜  19-21
    1.1.3 5型和8型荚膜的毒力  21-23
    1.1.4 5型和8型荚膜多糖在动物模型中的保护作用  23
  1.2 金黄色葡萄球菌毒素及其作为疫苗在动物模型中的保护作用  23-26
    1.2.1 α-毒素  24-25
    1.2.2 PVL-杀白细胞素  25-26
  1.3 本研究涉及的金黄色葡萄球菌感染及其免疫防治策略研究进展  26-43
    1.3.1 金黄色葡萄球菌奶牛乳房炎  26-34
      1.3.1.1 金黄色葡萄球菌奶牛乳房炎简介  26-28
      1.3.1.2 金黄色葡萄球菌性乳房炎疫苗研究进展  28-30
      1.3.1.3 卵黄抗体(IgY)简介  30-32
      1.3.1.4 卵黄抗体在家畜疾病防治中的应用  32-34
    1.3.2 人类主要的金黄色葡萄球菌感染  34-43
      1.3.2.1 金黄色葡萄球菌菌血症和心内膜炎概述  34-35
      1.3.2.2 金黄色葡萄球菌肺炎概述  35
      1.3.2.3 人用金黄色葡萄球菌疫苗研究进展  35-43
  1.4 论文选题依据及研究内容  43-46
    1.4.1 选题依据  43
    1.4.2 研究内容  43-46
2 金黄色葡萄球菌荚膜及外毒素特异性IGY治疗奶牛乳房炎效果研究  46-68
  2.1 金黄色葡萄球菌荚膜特异性IgY的制备及体外活性研究  46-58
    2.1.1 引言  46
    2.1.2 实验材料  46-48
    2.1.3 实验方法  48-50
      2.1.3.1 三种荚膜血清型全菌抗原的获得  48
      2.1.3.2 蛋鸡免疫  48-49
      2.1.3.3 检测卵黄中特异性IgY水平  49
      2.1.3.4 检测三种IgY的荚膜特异性(ELISA)  49
      2.1.3.5 大规模分离纯化IgY  49
      2.1.3.6 纯化IgY的SDS-PAGE  49-50
      2.1.3.7 荚膜特异性IgY的体外抑菌实验  50
      2.1.3.8 细菌侵袭乳腺上皮细胞(MAC-T细胞)实验  50
    2.1.4 实验结果  50-55
      2.1.4.1 金黄色葡萄球菌全菌疫苗免疫后IgY水平变化  50-51
      2.1.4.2 纯化IgY的SDS-PAGE  51-52
      2.1.4.3 荚膜特异性IgY的体外抑菌效果  52-53
      2.1.4.4 三种IgY对金黄色葡萄球菌荚膜的特异性(交叉反应)  53-54
      2.1.4.5 三种荚膜特异性IgY阻断金黄色葡萄球菌入侵MAC-T细胞  54-55
    2.1.5 讨论  55-57
    2.1.6 小结  57-58
  2.2 金黄色葡萄球菌外毒素及荚膜特异性卵黄抗体联合治疗临床型乳房炎效果  58-68
    2.2.1 引言  58
    2.2.2 实验材料  58-60
    2.2.3 实验方法  60-62
      2.2.3.1 金黄色葡萄球菌外毒素的分离  60
      2.2.3.2 蛋鸡免疫  60
      2.2.3.3 检测卵黄中抗毒素IgY水平变化  60
      2.2.3.4 抗外毒素IgY的分离纯化及其SDS-PAGE  60
      2.2.3.5 牛外周血嗜中性粒细胞(PMNs)的分离  60-61
      2.2.3.6 乳酸脱氢酶(LDH)实验检测IgY对奶牛细胞的保护作用  61
      2.2.3.7 细菌侵袭乳腺上皮细胞(MAC-T)实验  61-62
      2.2.3.8 临床型乳房炎实验  62
    2.2.4 实验结果  62-66
      2.2.4.1 卵黄中抗外毒素IgY水平的变化  62-63
      2.2.4.2 抗外毒素IgY的SDS-PAGE  63
      2.2.4.3 抗外毒素IgY有效中和外毒素对牛PMNs和MAC-T细胞的裂解  63-64
      2.2.4.4 抗外毒素及荚膜IgY联合使用有效阻断金葡菌入侵MAC-T细胞  64-65
      2.2.4.5 抗外毒素及荚膜IgY联合使用对临床型乳房炎的治疗效果  65-66
    2.2.5 讨论  66-67
    2.2.6 小结  67-68
3 金黄色葡萄球菌荚膜多糖-外毒素生物结合疫苗预防人类感染疾病效果研究  68-124
  3.1 荚膜多糖-外毒素生物结合疫苗体外功能性研究  68-82
    3.1.1 引言  68-69
    3.1.2 实验材料  69-70
      3.1.2.1 人永生化PMNs(HL60细胞系)调理吞噬杀伤实验所用材料  69
      3.1.2.2 人原代PMNs调理吞噬杀伤实验所用材料  69-70
      3.1.2.3 毒素中和实验所用材料  70
    3.1.3 实验方法  70-74
      3.1.3.1 人HL60细胞系调理吞噬杀伤实验  70-72
      3.1.3.2 人原代PMNs调理吞噬杀伤实验  72-73
      3.1.3.3 毒素中和实验方法  73-74
    3.1.4 实验结果  74-80
      3.1.4.1 抗体αCP5-Epa,αCP5-Hla,αCP8-Epa调理金葡菌被HL60噬杀  74-75
      3.1.4.2 抗体αCP5-Epa有效调理金黄色葡萄球菌被原代PMNs噬杀  75-77
      3.1.4.3 抗体αCP5-Epa对荚膜的特异性  77-78
      3.1.4.4 特异性抗血清(鼠抗)有效调理杀伤金黄色葡萄球菌  78-79
      3.1.4.5 抗体α CP5-Hla有效中和金黄色葡萄球菌α-毒素的细胞毒作用  79-80
    3.1.5 讨论  80-81
    3.1.6 小结  81-82
  3.2 荚膜多糖生物结合疫苗对系统性感染-菌血症的预防效果  82-101
    3.2.1 引言  82
    3.2.2 实验材料  82-83
    3.2.3 实验方法  83-87
      3.2.3.1 本实验中佐剂(铝剂)的选择依据  83-84
      3.2.3.2 主动免疫方法  84-85
      3.2.3.3 应用ELISA检测荚膜多糖特异性抗体  85-86
      3.2.3.4 被动免疫方法  86-87
      3.2.3.5 小鼠菌血症模型的建立  87
    3.2.4 实验结果  87-99
      3.2.4.1 主动免疫CP5-Epa的最佳剂量为0.2μg CP5-2 μg Epa  87-88
      3.2.4.2 主动免疫CP5-Epa对菌血症的预防效果  88-90
      3.2.4.3 被动免疫αCP5-Epa对菌血症的预防效果  90-92
      3.2.4.4 主动免疫CP5-Hla对菌血症的预防效果  92-96
      3.2.4.5 被动免疫α CP5-Hla对菌血症的预防效果  96-97
      3.2.4.6 主动及被动免疫CP8-Epa对菌血症的预防效果  97-99
    3.2.5 讨论  99-100
    3.2.6 小结  100-101
  3.3 多糖-外毒素生物结合疫苗对局部感染-肺炎的预防效果  101-114
    3.3.1 引言  101
    3.3.2 实验材料  101-102
    3.3.3 实验方法  102-104
      3.3.3.1 小鼠肺炎模型的建立  102-103
      3.3.3.2 T细胞剔除实验  103-104
    3.3.4 实验结果  104-112
      3.3.4.1 主动免疫CP5-Hla对致死性肺炎的预防效果  104-106
      3.3.4.2 单剂被动免疫αCP5-Hla对肺炎的预防效果  106-107
      3.3.4.3 主动免疫CP5-Hla预防肺炎过程中T细胞的作用  107-111
      3.3.4.4 双剂被动免疫αCP5-Hla对肺炎的保护效果  111
      3.3.4.5 金黄色葡萄球菌荚膜在肺炎中的毒力研究  111-112
    3.3.5 讨论  112-113
    3.3.6 小结  113-114
  3.4 抗CP5-Hla特异性抗体对导管所致感染-心内膜炎的预防效果  114-124
    3.4.1 引言  114
    3.4.2 实验材料  114-115
    3.4.3 实验方法  115-117
    3.4.4 实验结果  117-122
      3.4.4.1 攻毒前24h静脉注射1mg的α CP5-Hla的保护效果  117-119
      3.4.4.2 攻毒前24h腹腔注射15mg的αCP5-Hla的保护效果  119-122
    3.4.5 讨论  122-123
    3.4.6 小结  123-124
4 结论与展望  124-126
  4.1 结论  124
  4.2 创新点摘要  124-125
  4.3 展望  125-126
参考文献  126-139
附录A 本研究使用的仪器  139-141
附录B 图S1-S4  141-144
附录C 本研究中所用的统计学方法  144-145
攻读博士学位期间科研项目及科研成果  145-148
致谢  148-149
作者简介  149-150

相似论文

  1. 壳聚糖及其衍生物脱除牡蛎中麻痹性贝类毒素的研究,TS254.4
  2. 溶藻弧菌噬菌体、菌影疫苗及其对对虾免疫保护性的比较研究,S945
  3. 葡萄籽原花青素制备工艺及真菌毒素检测,TQ461
  4. HCV准种变异特性及其免疫逃逸机制初步研究,R392.1
  5. 甲型流感病毒M2蛋白的表达、纯化及其免疫原性的研究,R392
  6. 李贵教授学术经验及温肺化瘀定喘法治疗小儿毛细支气管炎的临床研究,R249.2
  7. 乳糖衍生物Gu-4对内毒素休克小鼠的治疗效应及其机理研究,R459.7
  8. Bt毒素寡聚体形成与脂筏的关系以及钙粘蛋白的免疫检测技术探索,S476.1
  9. 猪链球菌2型与猪胸膜肺炎放线杆菌基因工程亚单位疫苗的研究,S858.28
  10. 猪细小病毒河南流行株的分离、鉴定及部分生物学特性研究,S852.65
  11. 传染性法氏囊病病毒结构蛋白VP2基因在家蚕中的表达及亚单位疫苗的初步研究,S855.3
  12. 鸡传染性法氏囊病毒颗粒疫苗的研制及其免疫效果的研究,S858.31
  13. 黄曲霉毒素B1和脱氧雪腐镰刀菌烯醇诱导锦鲤原代肝细胞凋亡机制的初步研究,S856.9
  14. 乙型脑炎病毒NS1蛋白的新型prime-boost免疫策略研究,R392
  15. 奶牛隐性乳房炎主要病原菌及运用Nisin进行治疗的研究,S858.23
  16. 伏马菌素B1人工抗原制备及其蛋白质芯片检测方法的建立,S816.17
  17. 6年间儿科感染性疾病细菌谱及耐药性变迁临床研究,R446.5
  18. 甲乙肝联合疫苗和乙型脑膜炎疫苗接种后安全性评价的动物实验研究,R186
  19. 大连市海港集团职工幽门螺杆菌感染现状及相关因素调查研究,R181.3
  20. 金黄色葡萄球菌致病因子的检测及同源性分析,R446.5
  21. 成都地区儿童脓疱疮皮损中金黄色葡萄球菌药敏及随机扩增多态性DNA指纹分析,R440

中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 病原细菌 > 球菌
© 2012 www.xueweilunwen.com