学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

DCE-01菌株果胶酶基因克隆与表达及其多样性研究

作　者: 成莉凤
导　师: 刘正初
学　校: 中国农业科学院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: DCE-01 果胶酶 多样性 原核表达 酶学性质
分类号: Q936
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
下　载: 109次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


果胶酶是降解果胶类物质所需多种酶的总称。果胶酶的用途十分广泛，例如，用于饲料行业消除抗营养因子的添加剂，用于食品行业中果汁的提取和澄清处理，用于纺织业中麻类生物脱胶和棉纤维生物精炼以及用于造纸行业中的生物制浆。作为各行各业清洁生产的工具酶，碱性果胶裂解酶近年来受到越来越多的关注。本研究以基因组测序注释拥有14个果胶酶基因的麻类脱胶高效菌株DCE-01为基础，采用分子生物学、生物化学、酶学、结构生物学、生物信息学等方法，从基因水平和蛋白质酶学两个层面，开展果胶酶基因克隆及其表达产物的催化功能、酶学性质、分子结构等研究，获得如下结果：1.根据全基因组测序注释结果设计引物，从DCE-01菌株中成功克隆到14个果胶酶基因，包括11个果胶解聚酶基因、2个果胶酯酶基因和1个果胶脱乙酰基酶基因。其核苷酸序列与其他微生物来源的果胶酶基因核苷酸序列的一致性在71%-100%之间，其中，一致性高于95%的基因序列占1.8%，低于85%的基因序列占58.5%。DCE-01菌株所有14个果胶酶基因核酸序列之间的一致性在36.3%-84.2%之间；同样属于果胶解聚酶基因的核酸序列一致性同样在36.1%-84.2%之间，两个果胶酯酶的核酸序列一致性仅为42.8%。2.以果胶酶基因核苷酸序列为基础，生物信息学分析结果表明：DCE-01菌株14个果胶酶氨基酸序列与其他微生物的果胶酶氨基酸序列一致性在21%-100%之间，其中，氨基酸序列一致性在95%以上者占1.8%，一致性低于50%者占54.6%，与Dickeya dadantii3937的PelB（Pectate lyaseB）氨基酸序列比较，DCE-01菌株果胶解聚酶419在8个氨基酸位点上存在差异；DCE-01菌株的14个果胶酶氨基酸序列的一致性为16.4%-84.8%；MEGA聚类分析证明，该菌株果胶酶进化关系十分复杂。在14种果胶酶中，具有明显信号肽的果胶酶9种，没有明显信号肽的5种；定位在胞外的果胶酶10种，定位在胞内的2种，定位在细胞膜外膜的1种，无明确定位的1种；果胶酶分子量为30-90kDa；等电点为5.0-9.5。构建14个果胶酶基因的原核表达体系，平板水解圈法、酶活力测定法、SDS-PAGE电泳鉴定，有12个果胶酶基因获得成功表达，其中10个基因表达出具有生物活性的胞外果胶酶。经IPTG诱导，DNS法测定，有9个基因工程菌株的胞外果胶解聚酶活力为0.08-164.9IU/mL。深入研究结果表明，果胶解聚酶RP65、5P8、SH8和4J4的最适反应温度分别为50°C、45°C、50°C和55°C；最适pH均为8.5；热稳定温度分别为40°C、40°C、35°C和45°C；最适Ca2+终浓度分别为0.5mmol/L、0mmol/L、2.0mmol/L和1.0mmol/L；最适底物分别为酯化度20%-34%的橘子果胶、聚半乳糖醛酸钠、酯化度20%-34%的橘子果胶和酯化度≥85%的橘子果胶。3. Pel419的最适反应温度为50°C；保温1.0h，酶活稳定温度≤45°C；最适pH为9.0；稳定pH为8.5-10.0；Ca2+、Zn2+和NH4+促进酶活力，Ca2+的最适作用终浓度为2.0mmol/L，Fe3+、Pb2+和EDTA严重抑制酶活力；聚半乳糖醛酸钠为最适底物。PelG403最适反应温度为55°C；保温1.0h，酶活稳定温度≤60°C；最适反应pH为9.5；稳定pH为9.0-10.0；Ca2+能最大幅度提高酶活力，其最适作用终浓度为1.5mmol/L，Pb2+和EDTA能严重抑制酶活力；苹果果胶为最适底物。诱导基因工程菌株pEASY-E1-243/BL21表达有生物活性的胞外果胶酯酶，以高度酯化橘子果胶（DE≥85%）为底物，测定其发酵液酶活为1.5IU/mL，是原始菌株DCE-01的22.4倍。综上所述，本研究成功从DCE-01菌株中克隆出全基因组测序注释的14个果胶酶基因。通过系统研究果胶酶基因核苷酸序列及果胶酶分子结构、酶学性质、催化功能，证实DCE-01菌株果胶酶基因资源具有极为丰富的多样性。初步鉴定出在生物质加工过程中具有重要工业化应用前景的工具酶3种，为阐明麻类生物脱胶的作用机理提供科学依据，为发掘优异生物质加工用果胶酶资源奠定基础。

全文目录


附件  2-6
摘要  6-8
Abstract  8-15
英文缩略表  15-17
第一章 绪论  17-33
  1.1 果胶  17-18
    1.1.1 果胶定义  17
    1.1.2 果胶含量及化学结构  17-18
    1.1.3 果胶分类  18
  1.2 果胶酶及其多样性  18-27
    1.2.1 果胶酶多样性表现  19-26
    1.2.2 果胶酶多样性分析  26-27
  1.3 果胶酶的应用  27-29
    1.3.1 在植物韧皮纤维脱胶的应用  27
    1.3.2 在棉纤维生物精炼的应用  27-28
    1.3.3 在饲料工业的应用  28
    1.3.4 在食品工业的应用  28-29
    1.3.5 在污水处理的应用  29
    1.3.6 在生物制浆的应用  29
    1.3.7 在制药医疗的应用  29
    1.3.8 在植物病毒纯化的应用  29
  1.4 来源于同一菌株的多种果胶酶协同作用机理  29-32
  1.5 DCE-01 菌株特征  32
  1.6 本研究的内容、目的和意义  32-33
    1.6.1 本研究的内容  32
    1.6.2 本研究的目的和意义  32-33
第二章 DCE-01 菌株果胶酶基因克隆及其多样性分析  33-50
  2.1 材料和仪器  33-34
    2.1.1 菌株和质粒  33
    2.1.2 主要试剂  33
    2.1.3 主要仪器设备  33-34
    2.1.4 主要培养基  34
  2.2 方法  34-37
    2.2.1 引物设计  34-35
    2.2.2 DCE-01 菌株提纯复壮  35
    2.2.3 DCE-01 菌株基因组 DNA 提取  35-36
    2.2.4 果胶酶基因 PCR 扩增  36
    2.2.5 果胶酶基因重组子构建  36-37
    2.2.6 重组子筛选与目的基因片段验证  37
    2.2.7 果胶酶基因多样性分析  37
  2.3 结果与分析  37-48
    2.3.1 DCE-01 菌株基因组 DNA 提取  37-38
    2.3.2 果胶酶基因 PCR 扩增  38
    2.3.3 重组子筛选与鉴定  38-39
    2.3.4 果胶酶基因序列分析  39-47
    2.3.5 果胶酶基因多样性分析  47-48
  2.4 讨论  48-49
    2.4.1 DCE-01 菌株有望发掘到更多果胶酶基因资源  48
    2.4.2 DCE-01 菌株果胶酶基因呈现多样性  48-49
  2.5 小结  49-50
第三章 DCE-01 菌株果胶酶多样性  50-80
  3.1 材料和仪器  50-51
    3.1.1 菌株和质粒  50
    3.1.2 主要试剂  50
    3.1.3 主要仪器设备  50-51
    3.1.4 主要培养基  51
  3.2 方法  51-58
    3.2.1 果胶酶多样性预测  51
    3.2.2 引物设计  51-52
    3.2.3 质粒提取  52-53
    3.2.4 感受态细胞制备  53
    3.2.5 果胶酶基因扩增  53-54
    3.2.6 果胶酶基因表达体系构建  54
    3.2.7 重组子筛选与鉴定  54-55
    3.2.8 果胶酶诱导及酶液样品制备  55
    3.2.9 SDS-PAGE 电泳分析  55-56
    3.2.10 果胶酶活力检测  56-57
    3.2.11 果胶裂解酶酶学性质多样性  57-58
  3.3 结果与分析  58-77
    3.3.1 DCE-01 菌株果胶酶分子结构、酶学性质和催化功能分析  58-66
    3.3.2 DCE-01 菌株果胶酶氨基酸序列一致性分析  66
    3.3.3 DCE-01 菌株果胶酶聚类分析  66-67
    3.3.4 果胶酶基因扩增  67
    3.3.5 重组子筛选与鉴定  67-68
    3.3.6 SDS-PAGE 电泳分析  68-69
    3.3.7 果胶酶活力检测  69-72
    3.3.8 果胶酶酶学性质多样性  72-77
  3.4 讨论  77-79
    3.4.1 果胶酶分子结构  77
    3.4.2 果胶酶酶学性质  77
    3.4.3 果胶酶催化功能  77-78
    3.4.4 果胶酶基因工程菌株表达体系  78-79
  3.5 小结  79-80
第四章 果胶裂解酶纯化及酶学性质  80-90
  4.1 材料和仪器  80-81
    4.1.1 基因工程菌株  80
    4.1.2 主要试剂  80
    4.1.3 主要仪器设备  80-81
    4.1.4 主要培养基  81
  4.2 方法  81-83
    4.2.1 果胶裂解酶诱导  81
    4.2.2 果胶裂解酶活力测定  81
    4.2.3 超滤浓缩粗酶液  81
    4.2.4 Sephadex G-100 葡聚糖凝胶层析  81-82
    4.2.5 SDS-PAGE 电泳  82
    4.2.6 酶学性质  82-83
  4.3 结果与分析  83-88
    4.3.1 粗酶液果胶裂解酶活力  83
    4.3.2 Sephadex G-100 葡聚糖凝胶层析  83-84
    4.3.3 SDS-PAGE 电泳分析  84-85
    4.3.4 酶学性质  85-88
  4.4 讨论  88-89
  4.5 小结  89-90
第五章 DCE-01 菌株果胶酯酶的功能  90-93
  5.1 材料和仪器  90
    5.1.1 基因工程菌株  90
    5.1.2 主要试剂  90
    5.1.3 主要仪器设备  90
    5.1.4 主要培养基  90
  5.2 方法  90-91
    5.2.1 果胶酯酶诱导  90
    5.2.2 果胶酯酶活力测定  90-91
  5.3 结果与分析  91-92
    5.3.1 果胶酯酶活力半定量分析  91
    5.3.2 果胶酯酶活力定量分析  91-92
  5.4 讨论  92
  5.5 小结  92-93
第六章 全文结论  93-95
参考文献  95-105
致谢  105-106
附录  106-110
作者简历  110-111

相似论文

  1. 拟南芥胱硫醚-γ-合成酶（D-AtCGS）基因在大肠杆菌中的表达及抗血清制备,Q943.2
  2. 南极冰藻GPx、GST和SAHH基因的克隆、定量分析及原核表达载体的构建,Q943.2
  3. 紫金山树木菌根多样性的调查分析,S718.81
  4. 草鱼呼肠孤病毒vp5、vp7基因cDNA的克隆、表达及VP5、VP7蛋白亚细胞定位研究,S941.41
  5. 草鱼呼肠孤病毒vp6和ns38基因的克隆、表达及VP6和NS38免疫原性研究,S941.41
  6. 夏季湖光岩玛珥湖浮游细菌和浮游活性菌遗传多样性的比较,Q938
  7. 高位精养模式日本囊对虾生长及浮游生物演替规律,S968.22
  8. 易错PCR定向进化扩展青霉FS1884脂肪酶,Q78
  9. 云南元江干热河谷优势植物内生真菌多样性及其次生代谢产物研究,X172
  10. 不同类型稻田非作物生境的节肢动物多样性,S435.112
  11. 竹黄及其分离真菌的遗传多样性分析,S567.39
  12. 福建兴化湾西岸越冬水鸟多样性与生境选择研究,Q958
  13. 碱性果胶酶在蔗汁澄清过程中的应用研究,TS244.2
  14. 小麦黄花叶病毒（WYMV）RNA2编码基因的功能研究,S435.121
  15. 河南省小麦纹枯病菌致病力分化及遗传多样性研究,S435.121
  16. 红笛鲷清道夫受体B型Ⅰ类和抗冻蛋白Ⅱ型基因的克隆、表达与定量分析,S917.4
  17. 羊种布鲁氏菌16M优势蛋白抗原的鉴定,S852.61
  18. Thermobifida Halotolerans YIM 90462~T木聚糖酶基因克隆表达以及酶学特性研究,Q78
  19. 中国玉米南方锈菌的分子遗传多样性和超微结构研究,S435.131.4
  20. 夏南牛和皮南牛微卫星标记研究及生长发育模型的建立,S823
  21. 鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定及S1、N基因的序列分析,S852.65

中图分类: > 生物科学 > 微生物学 > 微生物生物化学
© 2012 www.xueweilunwen.com