学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

与钙离子调控因子ScRch1定位相关的酵母基因筛选

作　者: 赵刚
导　师: 蒋伶活
学　校: 江南大学
专　业: 发酵工程
关键词: 钙离子 ScRCH1 细胞膜定位基因筛选荧光
分类号: Q93
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 12次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

钙离子是重要营养因子，同时也是生物必需的金属离子，可以调节真核细胞中很多重要的细胞过程。在人体中钙离子的稳态的紊乱，可以导致很多人体疾病。因此研究酿酒酵母细胞中钙离子稳态的调控机制，能为人们研究很多人体疾病致病机制提供重要线索。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）细胞中的基因YMR034c与白念珠菌（Candidaalbicans）的基因CaRCH1同源，因此，我们把YMR034c命名为ScRCH1。之前的研究认为，YMR034c与唑类药物的抗性有关，目前还没有对YMR034c其他功能的报道。本实验室的研究发现，在胞外高浓度钙离子条件下，ScRch1定位于细胞膜上，与酿酒酵母细胞中钙离子的稳态调控有关。为了找出与ScRch1蛋白细胞质膜定位相关的基因，本试验构建了表达ScRch1-GFP融合蛋白的表达质粒pGFP33-ScRCH1，我们把表达质粒导入酿酒酵母双倍体单基因缺失株文库中，转化子经过钙离子处理，通过荧光显微镜观察每个缺失株中ScRch1-GFP的亚细胞定位情况，筛选经钙离子处理细胞质膜上没有荧光信号的菌株和不经钙离子处理细胞质膜上有荧光信号的单基因缺失菌株，从而找出影响ScRch1蛋白合成、运输和细胞膜定位的所有基因。除去223个转录因子基因的缺失菌株外，本研究对缺失株文库中4534个非必需基因缺失株进行了筛选。我们共筛到127个与ScRch1细胞膜定位相关的基因，其中加钙处理之后，没有ScRch1细胞膜定位的菌株为94个；没有加钙处理就有ScRch1细胞膜定位的菌株为33个。筛选到的127个基因中，值得我们重点研究的是与细胞运输和蛋白质折叠修饰相关的基因以及编码的蛋白定位在细胞质膜、液泡、内膜和脂质颗粒上的基因。在细胞运输、运输结构和运输路径上起功能的基因有13个，其中有11个基因与液泡上转运蛋白及蛋白通道有关；与细胞代谢有关的基因14个，其中2个基因分别编码酯酶和脂酶，10个基因与磷酸肌醇和磷脂合成有关。鉴于我们筛选到很多与脂质代谢相关的基因和脂质在细胞信号传导、蛋白膜定位等方面的重要作用，为了进一步了解脂质与ScRch1细胞质膜定位的关系，我们利用荧光染色方法测定筛选到的127个菌株细胞内脂滴含量。发现23个基因缺失株细胞内脂滴指数比野生型高20%以上，15个基因缺失株细胞内脂滴指数比野生型低20%以上。此外，利用荧光显微镜观察计算这些菌株细胞内的平均脂滴个数，发现同一菌株的脂滴指数与其平均的脂滴个数之间不成正比关系。本研究筛选到的与ScRch1细胞质膜定位的相关的127个基因，有助于进一步研究酿酒酵母中ScRch1细胞质膜定位机理，也为研究ScRCH1和钙离子稳态调控之间的关系奠定基础。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-7
第一章前言  7-13
  1.1 酵母菌及酿酒酵母  7-9
    1.1.1 酿酒酵母基因组  7-8
    1.1.2 酿酒酵母作为模式生物  8
    1.1.3 酿酒酵母双倍体单基因缺失株文库  8-9
  1.2 钙离子稳态调控  9-11
    1.2.1 酿酒酵母细胞内钙离子稳态调控机制  9-10
    1.2.2 钙调磷酸酯酶  10
    1.2.3 酿酒酵母基因 ScRCH1  10-11
  1.3 脂质与脂滴（Lipid droplet）  11-12
  1.4 本论文研究的意义  12-13
第二章试验材料与方法  13-20
  2.1 试验材料  13-15
    2.1.1 试验菌株  13
    2.1.2 试验所用试剂  13-14
    2.1.3 本试验所用主要仪器  14-15
    2.1.4 试验所用溶液及培养基的配制  15
  2.2 试验方法  15-17
    2.2.1 pGFP33-ScRCH1 质粒的构建  15
    2.2.2 碱裂解法质粒的小量提取  15-16
    2.2.3 pGFP33-ScRCH1 表达质粒转化酵母细胞  16
    2.2.4 荧光筛选试验细胞预处理  16
    2.2.5 荧光筛选试验细胞的荧光定位观察  16
    2.2.6 脂滴测定试验细胞的固定  16-17
    2.2.7 荧光酶标仪测定细胞 LD 指数（LD index）  17
    2.2.8 细胞中脂滴个数的荧光显微镜观察  17
  2.3 所用电子工具及荧光率分析方法  17-18
    2.3.1 SGD (Saccharomyces Genome Database)  17-18
    2.3.2 MIPS (Munich Information center for Protein Sequences)  18
    2.3.3 荧光率分析  18
  2.4 实验方法  18-20
    2.4.1 酿酒酵母文库筛选试验  18-19
    2.4.2 脂滴指数（LD index）及平均脂滴数测定试验  19-20
第三章结果与讨论  20-46
  3.1 pGFP33-SCRCH1 质粒的构建  20
  3.2 用荧光方法对酿酒酵母缺失株的文库筛选  20-40
    3.2.1 加 CaCl2处理之后细胞有 ScRch1 细胞膜定位的菌株结果及分析  20-23
    3.2.2 加 CaCl2处理之后细胞无 ScRch1 细胞膜定位的筛选结果及分析  23-32
    3.2.3 不经 0.2 mol/L CaCl2处理就有 ScRch1 细胞质膜定位的缺失菌株  32-36
    3.2.4 总结和讨论  36-40
  3.3 筛选菌株细胞内脂滴含量测定结果  40-46
第四章主要结论与展望  46-47
  4.1 主要结论  46
  4.2 存在的问题与展望  46-47
致谢  47-48
参考文献  48-52
在学期间发表的与学位论文相关的研究成果清单  52

与钙离子调控因子ScRch1定位相关的酵母基因筛选

内容摘要

全文目录

相似论文