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弯孢属种分子鉴定体系的建立及其在疑难种上的应用

作　者: 王昌亮
导　师: 张猛
学　校: 河南农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 弯孢属形态分类基因筛选变异性保守性系统发育分析 DNA条码
分类号: Q949.32
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

弯孢属(Curvularia)真菌多生于禾本科植物,是重要的植物病原菌,对其准确鉴定,是诊断植物病害的需要,也是进行该属真菌系统演化研究的基础。弯孢属的部分种受环境影响变异较大,通过形态特征对其分类有一定的随意性。本研究以形态特征为基础,分析适合真菌分类的部分基因在弯孢属种内、种间的变异性和保守性,筛选出适合弯孢属种分类的基因,初步建立弯孢属种分子鉴定体系,同时结合形态特征对弯孢属的疑难种准确鉴定。2008—2011年,从全国各地采集标本1000余份,所有标本经保湿培养、组织分离,得到部分弯孢属真菌,加上本实验室保存的及从国内外同行、研究机构惠赠的弯孢属菌株,共获得近350个弯孢属菌株。对收集到的所有弯孢属菌株进行标准培养、形态特征观察,根据形态特征鉴定出弯孢属真菌23个已知种和3个未知种。在形态分类的基础上,筛选出形态稳定的弯孢属14个种40个菌株,利用7个候选基因(5.8S/ITS、Gpd、Brn1、大亚基rRNA D1/D2、ACT、CAL和EF-1α)的特异引物(CAL特异引物为本研究设计),对所有供试菌株进行PCR扩增、纯化,测序,分析所有供试弯孢属菌株种内、种间各基因的变异性与保守性,同时结合供试菌株的7个候选基因PCR扩增率及其序列成功获取率,筛选出适合弯孢属种分类的基因条码。本研究成功获得弯孢属供试菌株7个候选基因序列共计255条。其中供试弯孢属菌株的rDNA5.8S/ITS、rDNA D1/D2、Gpd和ACT基因PCR扩增及其序列成功获取率均高达100%,弯孢属种内、种间Gpd、ACT基因保守性和变异相对稳定,能够准确区分参试弯孢属种,可作为弯孢属种间鉴定理想的基因条码;rDNA5.8S/ITS基因序列比Gpd和ACT更保守,但对多数种可以区分,对个别相似种不能区分,该基因作为真菌分类鉴定主要的分子依据已经被多数专家、学者认可,GenBank中物种序列最多,因此在弯孢属分子鉴定体系中,该基因可作为首选基因;CAL、EF-1α基因也能将弯孢属多数种明确区分,但其PCR扩增和序列成功获取率相对低于Gpd、ACT基因,在弯孢属分子鉴定体系中可作为补充基因,增加弯孢属种间遗传信息量。Brn1基因的PCR扩增和序列成功获取率较低(55%),大亚基rDNA D1/D2核苷酸序列高度保守,不能将弯孢属多数种明确区分,不适合弯孢属种间鉴定。研究过程中发现的三个未知种,经过形态特征和遗传信息分析,最终将其确定为弯孢属的三个新种,并将其分别命名为:ZMJ23:Curvularia trifolicola Meng Zhang,T. Tsukiboshi & C.L. Wang,sp. nov.;ZM10088:Curvularia fatsia Meng Zhang & C.L. Wang,sp. nov.;ZM10255-1:Curvularia fujianensis Meng Zhang & C.L. Wang,sp. nov.本研究建立的以rDNA5.8S/ITS、Gpd、ACT为首选基因,CAL、EF-1α为候补基因的弯孢属种分子鉴定体系,为弯孢属快速、准确鉴定提供了可靠的技术平台,解决了弯孢属疑难种的鉴定问题,为弯孢属基因条码工程奠定了基础。本研究所有标本、菌株、及三个新种的模式菌株均保藏在河南农业大学植物病理标本室。

全文目录

摘要 7-81 文献综述 8-20 1.1 弯孢属（Curvularia）分类研究进展 8-12 1.1.1 弯孢属真菌的经济意义 8 1.1.2 弯孢属的研究历史 8-9 1.1.3 国内弯孢属研究进展 9 1.1.4 弯孢属与其相似属的关系 9-11 1.1.5 弯孢属的有性态 11-12 1.2 现代分子技术在真菌分类中的应用 12-17 1.2.1 DNA 中G＋C mol％含量测定 12 1.2.2 基于PCR 基础上的DNA 多态性分析 12-14 1.2.3 DNA 核苷酸序列分析 14-17 1.3 DNA 基因条码 17-20 1.3.1 DNA 条形码的定义 18 1.3.2 DNA 条形编码的意义 18 1.3.3 作为DNA 条形编码序列的特点及DNA 条形编码操作 18-19 1.3.4 DNA 条形编码的发展及研究进展 19 1.3.5 我国开展真菌的DNA 条形编码现状 19-202 引言 20-213 材料与方法 21-26 3.1 弯孢属真菌菌株收集 21-22 3.1.1 实验材料 21 3.1.2 研究方法 21-22 3.2 弯孢属菌种形态学鉴定 22 3.2.1 弯孢属菌株的标准培养 22 3.2.2 制作玻片 22 3.2.3 描述鉴定 22 3.3 弯孢属真菌多基因筛选 22-26 3.3.1 实验材料 22-24 3.3.2 弯孢属菌株基因组DNA 的提取与检测 24 3.3.3 供试基因片段的PCR 扩增 24-26 3.3.4 DNA 核苷酸序列分析 264 结果与分析 26-57 4.1 菌株收集及形态鉴定 26-30 4.1.1 本研究用于分子分析的14 个弯孢属形态描述 27-30 4.2 部分菌株DNA 模板检测结果 30-31 4.3 DNA 序列比较及发育分析 31-49 4.3.1 rDNA-ITS 核苷酸序列比较及发育分析 31-35 4.3.2 Gpd 核苷酸序列比较及发育分析 35-39 4.3.3 Brn1 核苷酸序列比较及发育分析 39-41 4.3.4 大亚基rRNA D1/D2 序列比较及发育分析 41-43 4.3.5 ACT 核苷酸序列比较及发育分析 43-44 4.3.6 CAL 核苷酸序列比较及发育分析 44-47 4.3.7 EF-1α核苷酸序列比较及发育分析 47-49 4.4 候选基因评价 49-50 4.5 未知种的鉴定 50-57 4.5.1 未知种的形态描述 50-51 4.5.2 未知种的分子鉴定 51-575 结论与讨论 57-60 5.1 筛选出适于弯孢属种间鉴定的 5 个 Barcoding 基因:rDNA5.8S/ITS、Gpd、ACT、CAL 和 EF-1α 57-58 5.2 初步建立并验证了弯孢属种分子鉴定体系 58 5.3 鉴定出三种弯孢属新种 58-60参考文献 60-66ABSTRACT 66-67

弯孢属种分子鉴定体系的建立及其在疑难种上的应用

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