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提高木霉属纤维素酶系中β-葡萄糖苷酶活性的研究

作　者: 李敏霞
导　师: 李敬龙
学　校: 齐鲁工业大学
专　业: 生物化工
关键词: 绿色木霉诱变分离纯化酶学性质
分类号: Q936
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

β-葡萄糖苷酶在生物能源、保健品、食品等领域具有广阔的应用前景。而且该酶是纤维素酶系中的关键组分，在纤维素降解过程中起着限速酶的作用。木霉是世界公认的纤维素酶的产量比较高的菌种之一。然而该霉所产β-葡萄糖苷酶的活性普遍偏低。因此，培育高产β-葡萄糖苷酶的木霉菌株具有重要意义。对出发菌株绿色木霉AS3.3711进行UV、DES、和NaNO2复合诱变后，通过筛选得到了酶活较高突变菌株U3D2Na22，其产β-葡萄糖苷酶的酶活为0.74IU/mL，是原始菌株AS3.3711的3.2倍。通过单因素实验结合正交设计的方法，对绿色木霉U3D2Na22产酶培养基的组分进行分析，确定其最适产酶培养基组成为：碱稻草0.69%、乳糖0.33%、蛋白胨2%、硫酸铵0.5%、NaH2PO40.3%、CaCO30.2%。通过实验确定绿色木霉U3D2Na22的最适发酵条件为：发酵液初始pH4.0，发酵温度30℃，培养时间132h，当发酵培养进行到72h时补加碳、氮源能够显著的提高绿色木霉U3D2Na22的产酶量。粗酶液通过硫酸铵分级沉淀除去部分杂蛋白，通过透析除去酶液中的离子，通过葡聚糖凝胶层析获得β-葡萄糖苷酶溶液。最后，通过SDS-PAGE鉴定该酶的相对分子量为66.0KDa。酶学分析表明，绿色木霉U3D2Na22所产β-葡萄糖苷酶的酶学性质为最适温度60℃；该酶在10~60℃的温度范围内具有较好的热稳定性；最适pH为5.6，该酶有较强的耐酸能力，在酸性（pH3~6.6）条件下可以保持较好的活性；Na+、Mg2+、Mn2+、Fe2+、Co2+、Al3+等离子对绿色木霉U3D2Na22所产的β-葡萄糖苷酶具有一定激活作用；而Ag+、Fe3+、Zn2+、K+、Cu2+则对该酶具有抑制作用；EDTA可以显著提高酶活。

全文目录

摘要  8-9
Abstract  9-11
第一章绪论  11-17
  1.1 木霉简介  11
  1.2 纤维素与纤维素酶  11-12
  1.3 β-葡糖苷酶的来源、分类以及结构  12-14
    1.3.1 β-葡糖苷酶的来源  12-13
    1.3.2 β-葡萄糖苷酶的分类  13
    1.3.3 β-葡萄糖苷酶的结构  13-14
  1.4 β-葡萄糖苷酶的理化性质  14
  1.5 β-葡萄糖苷酶的底物特异性以及该酶的催化机制  14-15
    1.5.1 β-葡萄糖苷酶底物特异性的研究  14
    1.5.2 β-葡萄糖苷酶的催化机制  14-15
  1.6 β-葡萄糖苷酶的应用  15-16
    1.6.1 在工业生产中的应用  15
    1.6.2 在医药保健方面的应用  15
    1.6.3 在农业中的应用  15-16
  1.7 本文研究的意义  16-17
第二章绿色木霉的复合诱变  17-31
  2.1 引言  17-19
    2.1.1 诱变育种原理  17
    2.1.2 纤维素酶菌种选育情况  17-18
    2.1.3 β-葡萄糖苷酶酶活的测定方法  18
    2.1.4 代表性菌种的选择  18-19
  2.2 实验材料与方法  19-21
    2.2.1 实验材料  19
    2.2.2 主要试剂  19
    2.2.3 实验用主要仪器  19-20
    2.2.4 溶液及培养基的制备  20-21
  2.3 实验方法  21-23
    2.3.1 实验的一般步骤  21
    2.3.2 复合诱变及筛选方法  21-22
    2.3.3 诱变致死率  22
    2.3.4 液体发酵培养  22
    2.3.5 β-葡萄糖苷酶的活性的测定  22-23
    2.3.6 产酶的遗传稳定性研究  23
  2.4 实验结果与分析  23-28
    2.4.1 高产菌株的筛选  23-25
    2.4.2 β-葡萄糖苷酶活测定  25-27
    2.4.3 诱变绿色木霉菌株 U3D2Na22 产酶的遗传稳定性  27-28
  2.5 讨论  28-29
  2.6 本章小结  29-31
第三章诱变菌株产酶及发酵条件的优化  31-49
  3.1 引言  31-34
    3.1.1 纤维素酶的发酵方法  31-32
    3.1.2 发酵培养基  32-33
    3.1.3 培养基及发酵条件优化  33
    3.1.4 优化产酶培养基的意义  33-34
  3.2 实验材料  34-35
    3.2.1 菌株  34
    3.2.2 主要试剂  34
    3.2.3 实验用仪器  34-35
    3.2.4 溶液及培养基配制  35
  3.3 实验方法  35-36
    3.3.1 绿色木霉 U3D2Na22 产酶曲线的绘制  35
    3.3.2 培养基优化的单因素实验  35-36
    3.3.3 正交实验  36
  3.4 发酵条件的优化  36
  3.5 产酶培养基优化实验结果  36-44
    3.5.1 绿色木霉 U3D2Na22 产酶过程分析  36-37
    3.5.2 培养基单因素条件优化  37-42
    3.5.3 正交实验与方差分析  42-44
  3.6 诱变菌株 U3D2Na22 发酵条件优化实验结果  44-47
  3.7 讨论  47
  3.8 本章小结  47-49
第四章 β-葡萄糖苷酶的分离及酶学性质的研究  49-69
  4.1 引言  49-52
    4.1.1 β-葡萄糖苷酶的分离、纯化技术  49-50
    4.1.2 凝胶柱层析的原理  50-52
  4.2 实验材料  52-54
    4.2.1 突变菌株  52
    4.2.2 实验主要仪器  52-53
    4.2.3 实验用主要仪器  53-54
    4.2.4 培养基的配制  54
  4.3 实验方法  54-60
    4.3.1 考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量  54-55
    4.3.2 发酵液的粗分离  55
    4.3.3 利用葡聚糖凝胶柱层析分离纯化β-葡萄糖苷酶  55-56
    4.3.4 SDS-PAGE 电泳测定分子量  56-60
  4.4 实验结果  60-67
    4.4.1 β-葡萄糖苷酶分离纯化结果  60-62
    4.4.2 绿色木霉 U3D2Na22 产β-葡萄糖苷酶的理化性质  62-67
  4.5 讨论  67
  4.6 小结  67-69
结论  69-71
参考文献  71-77
致谢  77-79
在学期间主要研究成果  79

提高木霉属纤维素酶系中β-葡萄糖苷酶活性的研究

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