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果胶高效降解菌株的紫外诱变选育、生物特性及其生物脱胶应用研究

作　者: 谢维
导　师: 徐朗莱
学　校: 南京农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 紫外诱变软腐果胶杆菌软腐亚种菌果胶嗜碱性果胶酶生物脱胶构树树皮
分类号: TS713
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

在造纸过程中,必须去除原料(木、麻、竹材和禾草等)中的果胶,使原料中纤维素得以分散,这是造纸生产中非常重要和关键的一个步骤。由于通常使用的化学法脱胶耗能太大且对环境污染很严重,因此现在人们逐渐转向采用堆沤微生物方法脱胶,但自然堆沤法的脱胶效率又比较低。所以,本研究首先在自然pH(pH=7.0)条件下从腐败的白菜叶片中驯化筛选了一株能有效降解果胶的软腐果胶杆菌软腐亚种菌[Pectobacterium carotovorum (subsp) carotovorum],再利用紫外线诱变技术诱变此菌株,选育出了在高pH(pH=10.0)下能够对果胶有降解功能的变异菌种；然后分别研究了在pH10.0条件下的温度、振荡速率、太阳光照、外加碳源和接种量等因素对该菌株降解果胶的影响以及该菌株应用于构树树皮的脱胶,以期最后为该菌在构树树皮等纤维原料生物制浆的实际应用中提供科学技术支持和依据。我们从腐败的白菜叶片中经富集分离到一株能以果胶为唯一碳源的果胶降解菌(菌株1),然后利用紫外线照射菌株1,通过紫外光照射时间和诱变菌致死率效应曲线确定了最佳照射时间为50s,菌株1诱变后获得三株正突变菌株(菌株M2、M3、M4)。然后,对这些菌株的生物学特性进行了研究,结果显示,菌株M2培养1.5h后进入对数生长期,11h到达菌体的最大生长量,OD600达到了0.581,产果胶酶时间提前；出发菌株1对果胶溶液中果胶的降解率为30.4%,而菌株M2的降解率最高,比出发菌株1的降解率增加了47.7%,达到了78.1%,其多聚半乳糖醛酸酶活性可达到237.6U/ml,比出发菌株1的117.8U/ml提高了1倍多,说明菌株M2是一株降解果胶的优良诱变菌株。菌株M2生长及其降解果胶的生物学特性研究结果表明：该菌株生长最佳培养条件为：pH=10.0,温度32℃,震荡速率200r/min,接种量5%,在高pH10下能高效降解果胶。另外,当在培养基中加入0.2g/L葡萄糖时,可提高菌株M2降解果胶的效率达到82.1%。构树树皮微生物脱胶的试验还表明,加入1%碳酸钠的菌株M2液体发酵48h后,大部分树皮得到软化,黑皮基本上可自行脱落,树皮成浆得率较高,达到67.16%。因此,该菌株M2是一株很有希望用于制纸业中生物制浆的优良菌种。

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摘要 7-8ABSTRACT 8-10第一章绪论 10-16 1.1 本研究课题的来源、研究目的及意义 10-11 1.1.1 课题来源 10 1.1.2 研究目的 10 1.1.3 研究意义 10-11 1.2 造纸过程中的脱胶方法 11-13 1.2.1 化学脱胶法 11-12 1.2.2 微生物脱胶法 12-13 1.2.2.1 天然水沤麻微生物脱胶法 12-13 1.2.2.2 人工接种微生物脱胶法 13 1.3 微生物脱胶的国内外现状 13-14 1.4 本研究的思路和设计 14-15 1.4.1 果胶降解菌的筛选及其紫外诱变试验 14 1.4.2 高效降解果胶菌株的最适生长及降解果胶条件试验 14-15 1.4.3 果胶降解菌生物脱胶应用试验 15 1.5 本研究的特色和创新之处 15-16第二章果胶降解菌株的分离和筛选 16-22 2.1 试验材料和仪器设备 16-17 2.1.1 菌种来源 16 2.1.2 培养基 16 2.1.3 试剂 16-17 2.1.4 试验主要设备和仪器 17 2.2 试验方法 17-19 2.2.1 起始菌株的分离和筛选 17 2.2.2 菌悬液的制备 17 2.2.3 培养条件与方式 17-18 2.2.4 果胶含量的测定 18-19 2.2.4.1 吸收波长测定 18 2.2.4.2 葡萄糖含量标准曲线制作 18-19 2.3 结果与分析 19-20 2.4 小结 20-22第三章果胶降解菌的16S rDNA序列分析鉴定 22-30 3.1 材料与试剂 22-23 3.1.1 菌株 22 3.1.2 培养基 22 3.1.3 主要试剂 22-23 3.2 菌株1的16S rDNA鉴定方法 23-24 3.2.1 菌株1培养及其生长情况测定 23 3.2.2 菌株1基因组DNA的提取 23 3.2.3 菌株1基因组DNA的纯度鉴定 23 3.2.4 16S rDNA目标片段的PCR扩增 23-24 3.2.4.1 引物的设计 23-24 3.2.4.2 PCR反应条件 24 3.2.5 16S rDNA片段序列测定 24 3.2.6 16S rDNA序列比对,确定菌的种属和系统进化 24 3.3 结果与分析 24-30 3.3.1 菌株1的生长曲线 24-25 3.3.2 菌株1提取的基因组DNA检测 25 3.3.3 菌株1的16S rDNA序列比对 25-27 3.3.3.1 菌株1的16S rDNA PCR扩增 25 3.3.3.2 菌株1的16S rDNA序列测定及种属鉴定 25-27 3.3.4 菌株1的系统进化分析 27-30第四章果胶降解菌的紫外诱变筛选 30-36 4.1 试验材料 30 4.2 实验方法 30-32 4.2.1 紫外诱变的步骤 30 4.2.2 紫外诱变方法 30-31 4.2.3 诱变菌株的初筛 31 4.2.4 诱变菌株的复筛 31 4.2.5 细菌生长量的测定 31 4.2.6 多聚半乳糖醛酸酶活性的测定方法 31 4.2.7 数据处理 31-32 4.3 紫外诱变结果与分析 32-34 4.3.1 紫外诱变杀菌曲线的测定 32 4.3.2 正突变优势菌株的筛选 32-33 4.3.3 出发菌株和诱变菌株的生长曲线 33-34 4.3.4 诱变菌M2的多聚半乳糖醛酸酶活性 34 4.4 小结 34-36第五章菌株M2有效降解果胶的最佳条件研究 36-44 5.1 试验材料 36 5.2 实验方法 36-37 5.2.1 培养条件的优化 36-37 5.2.2 细菌生长量的测定 37 5.2.3 果胶含量的测定 37 5.3 结果与分析 37-42 5.3.1 温度对菌株降解果胶的影响 37-38 5.3.2 通气量(振荡速率)对菌株降解果胶的影响 38-39 5.3.3 接种量对菌株降解果胶的影响 39-40 5.3.4 太阳光照对菌株M2降解果胶的影响 40-41 5.3.5 葡萄糖浓度对菌株M2降解果胶的影响 41-42 5.4 小结 42-44第六章菌株M2的生物脱胶应用研究 44-48 6.1 材料与试剂 44 6.2 实验方法 44-45 6.2.1 培养基 44 6.2.2 多聚半乳糖醛酸酶活力测定 44 6.2.3 构树树皮软化脱离 44 6.2.4 构树树皮漂白 44-45 6.3 结果与分析 45-46 6.3.1 制浆条件 45-46 6.3.2 高碱性下脱除构树树皮作用 46 6.4 小结 46-48第七章讨论 48-52 7.1 紫外诱变的机理 48-52 7.1.1 紫外诱变的具体方法 48-49 7.1.2 果胶降解的分子机理 49-50 7.1.3 果胶生物降解的初步探讨 50-52 7.1.3.1 酶法脱胶制浆 50-51 7.1.3.2 发酵浸渍法脱胶制浆 51-52结论与展望 52-54创新之处 54-56参考文献 56-60致谢 60

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