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诱变选育棉籽粕高效脱毒菌株及其发酵条件筛选研究

作　者: 林海晶
导　师: 高峰
学　校: 南京农业大学
专　业: 动物营养与饲料科学
关键词: 菌种 诱变 棉酚降解率 ITS序列 棉籽粕 脱毒工艺
分类号: S816.6
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


本研究主要通过对性能优良的棉籽粕发酵菌株进行诱变选育,并对选育出来的菌种进行鉴定比较,最后对棉籽粕的发酵工艺参数条件进行筛选,阐明无论是单一诱变还是复合诱变都可以有效改良微生物性状,使棉籽粕脱毒效果显著提高,为棉酚脱毒开发了新的优质菌株,并为棉籽粕资源的广泛安全使用提供更为有力的理论支持和指导。试验共分为三个部分：第一部分：诱变选育棉籽粕高效脱毒菌株。本试验以本实验室前期研究得到的橄榄假丝酵母(Candida oleophila)、克雷克酵母(Kloeckera lindneri)、红酵母(Rhodothece glutinis)为出发菌株,采用物理诱变剂紫外线和化学诱变剂硫酸二乙酯(DES)对三株菌株进行单一诱变及复合诱变处理,选育出棉酚降解率较高的菌株,并确定了单一诱变和复合诱变的最佳诱变条件。研究结果表明：出发菌株经紫外线和DES诱变处理后,进行有利突变株的筛选,通过初筛、复筛,获得6株棉酚降解率较高的突变株(GJ-Z-25, GJ-D-25, GJ-Z-25-D-25, GJ-Z-20-D-20, HJ-D-20, HJ-Z-20-D-20),棉酚降解率分别高达90.69%、91.40%、89.64%、93.78%、90.78%和89.56%,比诱变前分别提高了50.00%、51.20%、48.29%、55.14%、26.33%和24.63%。通过本试验,获得了高浓度棉酚耐受菌株,并且所获菌株对棉酚降解率极显著提高,同时显著提高了棉粕营养价值。第二部分：诱变前后菌株的DNA鉴定与比较。试验采用EDTA (?)快速抽提各种真菌基因组DNA,利用一对真菌通用引物ITS1和ITS4扩增来源于同属、同一个种、不同变种的真菌的核糖体ITS片段,随后进行PCR产物纯化、测序。获得菌株的序列资料后,提交给NCBI的BLAST数据库进行序列相似性检索,将真菌鉴定到属、种、变种的水平。试验结果表明：通过NCBI的BLAST数据库和BLAST 2 SEQUENCE子库同源性比对,GJ-D-25, GJ-Z-25, GJ-Z-25-D-25是同一菌种,当Query coverage和Max ident都为100%时,诱变后菌株序列与Uncultured fungus ITS1,5.8S rRNA gene and ITS2 region, clone f4最为接近。当其Query coverage为99%, Max ident为100%时,测定的序列和Candida railenensis 18S rRNA gene (partial), ITS1,5.8S rRNA gene最为接近。通过BLAST 2 SEQUENCE子库同源性比对,HJ-D-20与原始菌株同源性只有94%,发生了显著地变异,经BLAST SEQUENCE同源性比对,HJ-D-20序列与Rhodosporidium paludigenum strain最为接近。第三部分：GJ-D-25发酵棉籽粕脱毒工艺参数的筛选。以游离棉酚(Free gossypol,FG)含量和粗蛋白(Crude Protein,CP)含量为指标,分别研究不同糖源,氮源,接种量,温度及时间对发酵效果的影响,试验最终得一套GJ-D-25建议发酵条件参数：底物组成为棉籽粕70%、玉米20%、麦麸10%,添加1%氯化铵,底物与水比例为1：0.8,接种量为5%,温度为30℃,发酵时间72h,自然pH。

全文目录


摘要  7-9ABSTRACT  9-11引言  11-12第一部分 文献综述  12-30  1 棉籽粕利用现状及主要问题  12-15    1.1 棉籽粕的营养价值及应用现状  12-13    1.2 棉籽饼粕中的有毒有害物质及抗营养因子  13-14    1.3 游离棉酚对动物的危害  14-15  2 微生物发酵棉籽粕研究利用现状  15-18    2.1 微生物发酵棉籽粕的方法  15-16    2.2 用于发酵棉籽粕的菌种  16-17    2.3 微生物发酵棉籽粕应用效果  17    2.4 微生物发酵棉籽粕存在问题  17-18  3 微生物诱变育种  18-21    3.1 出发菌株的选择  18    3.2 制备菌悬液  18    3.3 诱变处理  18-21    3.4 变异菌株的分离和筛选  21  4 DNA提取与PCR扩增  21-23  5 本研究目的意义、内容  23-24    5.1 研究目的意义  23    5.2 研究内容  23-24  参考文献  24-30第二部分 试验研究  30-62  试验一 诱变选育棉籽粕高效脱毒菌株的研究  30-40    1 材料与方法  30-33      1.1 试验材料  30-31      1.2 试验方法  31-33      1.3 数据统计方法  33    2 结果  33-37      2.1 紫外线最佳诱变时间的选择  33-34      2.2 DES最佳诱变时间的选择  34      2.3 紫外线与硫酸二乙酯最佳复合诱变条件的确定  34-35      2.4 突变株初筛结果  35-36      2.5 固体发酵复筛结果  36-37    3 讨论  37-38    4 小结  38    参考文献  38-40  试验二 诱变前后菌株的DNA鉴定与比较  40-54    1 材料与方法  40-42      1.1 试验材料  40-41      1.2 试验方法  41-42    2 结果与分析  42-44      2.1 诱变后菌株GJ-Z-25,GJ-D-25,GJ-Z-25-D-25,HJ-D-20 ITS-PCR结果  42      2.2 诱变后真菌菌株ITS-PCR产物序列测定结果  42-44    3 测得序列同源性比对  44-50      3.1 橄榄假丝酵母不同处理后菌株的差异比对结果  47-48      3.2 诱变后菌株与橄榄假丝酵母序列比对结果  48-49      3.3 HJ-D-20与红酵母5.8S rDNA+ITS2序列比对结果  49      3.4 HJ-D-20同源性比对结果  49-50    4 讨论  50-51    5 结论  51-52    参考文献  52-54  试验三 GJ-D-25发酵棉籽粕脱毒工艺参数的筛选  54-62    1 材料与方法  54-56      1.1 试验材料  54      1.2 试验方法  54-56      1.3 指标测定与数据统计  56      1.4 数据统计  56    2 结果与分析  56-60      2.1 发酵时间筛选研究  56-57      2.2 不同糖源筛选研究  57-58      2.3 不同氮源及其适宜添加量筛选研究  58-59      2.4 不同接种量筛选研究  59      2.5 发酵培养温度筛选研究  59-60    3 讨论  60-61    4 小结  61    参考文献  61-62全文结论  62-64致谢  64-66在读硕士学位期间论文发表情况  66

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 普通畜牧学 > 饲料 > 发酵饲料
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