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粘质沙雷氏菌的原生质体诱变及几丁质酶的研究

作　者: 张魁
导　师: 杨启银
学　校: 南京师范大学
专　业: 微生物学
关键词: 几丁质酶 复合诱变 条件优化
分类号: TQ925
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


本文为进一步提高粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)的几丁质酶活力,对本实验室分离并保存的一株粘质沙雷氏菌RZ21菌株,进行原生质体紫外线与NaNO2复合诱变,经过平板几丁质透明圈初筛与摇瓶复筛,筛选出一株高产几丁质酶的诱变株NU2,其所产几丁质酶的活力相比出发菌株提高了2.75倍,并对其产酶的培养基配方及培养条件进行了优化,最后做了几丁质酶的相关性质研究。在诱变实验中,首先分别进行了原生质体紫外线和化学诱变剂NaNO2的单因子诱变,结果表明,原生质体紫外线诱变的效果要好于化学诱变剂的；在复合诱变试验中,菌悬液先经过化学诱变剂NaNO2诱变之后再经原生质体的紫外线诱变的方法具有较好的诱变效果,HC值相比出发菌株CK提高了60.8%,且菌株的遗传稳定性较好。在培养基配方优化试验中,经过单因素试验与正交试验的优化,培养基配方确定为：最佳碳源为7.5g/L玉米粉,最佳氮源为5.0g/L蚕蛹粉,无机盐NaCl浓度为7.5g/L。除了传统碳氮源及无机盐条件的优化外,本研究结合几丁质酶的可诱导性,通过外加几丁质作为诱导剂提高了酶活的诱导效果。结果表明,胶体几丁质由于其颗粒较小,与酶的活性部位接触表面积较大等优点,诱导效果要优于粉末状几丁质,其中5mg/L的胶体几丁质的诱导效果最好；而粉末状150目的几丁质诱导效果略低于粉末状50目的几丁质。在培养条件优化方面,最佳培养条件为：培养温度30℃,初始pH8.0,装液量40mL/250mL,150rpm培养30h。在此最佳培养基配方及最佳培养条件下,粘质沙雷氏菌诱变株NU2所产几丁质酶的活力为410U,为初始培养基的4.23倍。采用25L发酵罐培养粘质沙雷氏菌NU2诱变株,菌悬液依次进行高压细胞破碎、硫酸铵沉淀与透析等方法提纯几丁质酶。用纯酶进行水解胶体几丁质的酶学性质研究,结果表明该诱变株NU2所产的几丁质酶有热稳定性及pH稳定性较好等优点。该酶的最适反应温度为37℃,在4-60℃之间酶活比较稳定。最适反应体系为pH8.0的0.02M磷酸盐缓冲液,酶在pH5.0-9.0之间较为稳定。镁离子对酶活促进较大,而金属离子螯合剂EDTA则抑制酶的活性。

全文目录


摘要  3-4Abstract  4-9第1章 绪论  9-20  1. 导言  9-18    1.1 几丁质酶及其分类  10-11    1.2 几丁质酶的分布  11-13      1.2.1 植物几丁质酶  11-12      1.2.2 动物几丁质酶  12      1.2.3 微生物几丁质酶  12-13        1.2.3.1 产几丁质酶微生物的类群  12-13        1.2.3.2 微生物几丁质酶的性质  13    1.3 微生物产几丁质酶的特性  13-14      1.3.1 多样性  13-14      1.3.2 诱导性  14      1.3.3 分泌性  14    1.4 微生物几丁质酶的理化性质  14-15      1.4.1 环境条件对酶活性的影响  14      1.4.2 分子量  14-15      1.4.3 等电点  15      1.4.4 金属离子的影响  15    1.5 几丁质酶的应用  15-17      1.5.1 植物几丁质酶的应用  15-16        1.5.1.1 参与植物抗胁迫反应  15        1.5.1.2 参与发育调控  15-16        1.5.1.3 其它生理功能  16      1.5.2 微生物几丁质酶的应用  16-17        1.5.2.1 抑制病原真菌生长,抵抗真菌感染  16        1.5.2.2 水解几丁质,制备壳寡糖  16        1.5.2.3 在抗病基因工程中的应用  16        1.5.2.4 在害虫防治中具有增效作用  16-17    1.6 粘质沙雷氏菌合成几丁质酶水解几丁质的研究进展  17-18    1.7 微生物产碱性几丁质酶研究和应用中所面临的问题  18  2. 实验设计  18-20第2章 产几丁质酶RZ21菌株的单诱变与复合诱变  20-31  2.1 引言  20  2.2 材料与方法  20-25    2.2.1 材料  20      2.2.1.1 菌种  20      2.2.1.2 培养基  20    2.2.2 主要试剂及来源  20-21    2.2.3 主要仪器设备型号及来源  21    2.2.4 试验方法  21-25      2.2.4.1 生长曲线及几丁质酶产酶曲线的测定  21      2.2.4.2 菌悬液的制备  21      2.2.4.3 菌体量的测定  21-22      2.2.4.4 原生质体的紫外线诱变  22      2.2.4.5 NaNO_2诱变  22-23      2.2.4.6 复合因素诱变  23      2.2.4.7 摇瓶复筛培养  23      2.2.4.8 诱变株的遗传稳定性研究  23      2.2.4.9 胶体几丁质的制备  23-24      2.2.4.10 几丁质酶活力的测定  24      2.2.4.11 DNS试剂的配制-Ghose法  24      2.2.4.12 DNS标准曲线  24-25  2.3 实验结果  25-29    2.3.1 粘质沙雷氏菌的生长曲线及产酶曲线  25-26    2.3.2 原生质体紫外线诱变结果  26-27    2.3.3 NaNO_2的诱变结果  27    2.3.4 复合诱变结果  27-28    2.3.5 摇瓶复筛结果  28-29    2.3.6 诱变菌株遗传稳定性的研究  29  2.4 讨论与分析  29-31第3章 产几丁质酶NU2诱变株的培养条件优化  31-46  3.1 引言  31  3.2 材料与方法  31-33    3.2.1 实验材料  31-32      3.2.1.1 出发菌株  31      3.2.1.2 培养基  31-32    3.2.2 主要试剂及来源  32    3.2.3 主要仪器设备型号及来源  32    3.2.4 实验方法  32-33      3.2.4.1 培养方法  32      3.2.4.2 测定方法  32      3.2.4.3 试验方法  32-33  3.3 实验结果  33-45    3.3.1 碳源筛选结果  33-34    3.3.2 氮源筛选结果  34-36    3.3.3 无机盐NaCl浓度的筛选  36-37    3.3.4 外加几丁质形态对酶活提高效果的影响  37-40      3.3.4.1 胶体几丁质对几丁质酶活力的提高效果  37-38      3.3.4.2 50目粉末几丁质对几丁质酶活力的提高效果  38-39      3.3.4.3 150目粉末几丁质对几丁质酶活力的提高效果  39-40    3.3.5 培养温度对诱变株NU2几丁质酶活力的影响  40    3.3.6 初始pH对诱变株NU2几丁质酶活力的影响  40-41    3.3.7 转速对诱变株NU2几丁质酶活力的影响  41-42    3.3.8 装液量对诱变株NU2几丁质酶活力的影响  42-43    3.3.9 接种量对诱变株NU2几丁质酶活力的影响  43    3.3.10 正交试验  43-45  3.4 讨论与分析  45-46第4章 NU2诱变株几丁质酶酶学性质研究  46-60  4.1 引言  46  4.2 材料与方法  46-50    4.2.1 材料  46-47      4.2.1.1 菌种  46      4.2.1.2 培养基  46-47    4.2.2 主要试剂及来源  47    4.2.3 主要仪器设备型号及来源  47    4.2.4 实验方法  47-50      4.2.4.1 几丁质酶的分离纯化  47-48      4.2.4.2 试剂配制  48-49      4.2.4.3 蛋白浓度测定方法  49      4.2.4.4 几丁质酶水解活性的测定方法  49-50      4.2.4.5 温度对几丁质酶活力的影响  50      4.2.4.6 pH对几丁质酶活力的影响  50      4.2.4.7 不同缓冲液对酶活力的影响  50      4.2.4.8 不同化学物质对几丁质酶活力的影响  50  4.3 实验结果  50-59    4.3.1 硫酸铵沉淀  50-51    4.3.2 透析  51    4.3.3 几丁质酶催化水解几丁质的最适作用温度  51-52    4.3.4 几丁质酶的热稳定性  52    4.3.5 几丁质酶催化水解几丁质的最适作用pH  52-53    4.3.6 几丁质酶的pH稳定性  53    4.3.7 不同缓冲液对酶活力的影响  53-54    4.3.8 金属及非金属离子对几丁质酶活力的影响  54-57      4.3.8.1 酸根离子对酶活的效应  54-55      4.3.8.2 正一价金属离子对酶活的效应  55      4.3.8.3 正二价金属离子对酶活的效应  55-56      4.3.8.4 正三价金属离子对酶活的效应  56-57      4.3.8.5 重金属离子对酶活的效应  57    4.3.9 EDTA对几丁质酶活力的影响  57    4.3.10 SDS-PAGE分析  57-59  4.4 讨论与分析  59-60第5章 结论与展望  60-62  5.1 结论  60  5.2 展望  60-62参考文献  62-67在读期间发表的学术论文及研究成果  67-68致谢  68

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 发酵工业 > 酶制剂（酵素）
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