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纤维素酶生产菌种的筛选鉴定与发酵产酶优化

作　者: 孙鸿金
导　师: 赵心清
学　校: 大连理工大学
专　业: 生物工程
关键词: 绿色木霉纤维素酶滤纸酶活力发酵优化木质纤维素还原糖
分类号: TQ925
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

纤维素酶在食品、饲料及生物能源生产等多个领域都有重要应用,因此其生产菌的开发和发酵生产受到各国学者的重视。本论文从山西玉米秸秆堆积处土壤、拉萨高山土壤和大连海泥样品中分离得到若干株具有纤维素水解活性的丝状真菌和放线菌,其中一株霉菌M20活性最好,ITS序列分析结果表明,该菌种与绿色木霉(Trichoderma viride)很相近,ITS序列最大相似度为97%。M20的产酶培养基发酵液具有降解纤维素的能力,对滤纸、羧甲基纤维素钠等纤维素的水解能力较强,也可以降解玉米秸秆、草坪草、落叶、菊芋秸秆等木质纤维素原料。进一步研究了所产纤维素酶的酶学性质,并优化了M20的产纤维素酶条件,主要实验结果如下：M20摇瓶发酵产纤维素酶的最佳诱导物为微晶纤维素,最佳添加量为0.5%。替代氨基酸的最佳氮源为蛋白胨,当初始pH为6,培养温度为28℃,发酵培养第7天时,滤纸酶活力(FPA)可以达到9.2 IU/ml。通过正交设计软件设计培养基组分添加量方案,滤纸酶活力(FPA)最优结果可以达到9.89 IU/ml,比对照提高了12%。M20所产纤维素酶在低温条件下保存2周酶活性变化不明显,但对60℃以上的高温较为敏感,其最佳酶反应条件是：温度50℃,pH为4.8。利用5L发酵罐培养M20进行发酵产酶实验,结果表明,产纤维素酶的酶活在第6天达到最高值,FPA可以达到8 IU/ml左右。调控pH先为4.8,生长2.5天以后,调控pH为6,并且在第三天一次性加入终浓度为5h/L的微晶纤维素,在发酵第5天FPA可以达到8 IU/ml,达到最高酶活时间提前了一天。用M20的发酵液可以水解不同的木质纤维素原料,利用HPLC测定还原糖释放含量,结果表明,玉米秸秆释放的葡萄糖与木糖含量最多,草坪草释放的葡萄糖含量比菊芋秸秆多,而落叶最少,水解释放的木糖含量比较结果表明,菊芋秸秆要多于落叶,而草坪草最少。这些结果表明,M20的发酵液可以水解不同来源的木质纤维素原料。

全文目录

摘要  4-5
英文摘要  5-11
引言  11-12
1 文献综述  12-25
  1.1 木质纤维素  12-16
    1.1.1 木质纤维素的组成  12-13
    1.1.2 木质纤维素的预处理  13-16
  1.2 纤维素酶研究意义  16
  1.3 纤维素酶简介  16-17
  1.4 纤维素酶作用机理  17-18
  1.5 纤维素酶活力的影响因素  18
  1.6 纤维素酶的合成机理  18-19
  1.7 纤维素酶的生产及分离纯化  19-20
    1.7.1 固体发酵产纤维素酶  19
    1.7.2 液体深层发酵  19-20
    1.7.3 纤维素酶的分离纯化  20
  1.8 纤维素酶的应用  20-22
    1.8.1 在发酵工业上的应用  20-21
    1.8.2 在纺织工业的应用  21
    1.8.3 在造纸工业的应用  21
    1.8.4 在纤维素乙醇开发利用方面应用  21-22
    1.8.5 在其他方面的应用  22
  1.9 生产纤维素酶的生物  22
  1.10 生产纤维素酶菌种的研究现状  22-23
  1.11 纤维素乙醇的发酵方式  23-24
  1.12 本课题的研究内容及意义  24-25
2 产纤维素酶的微生物筛选与鉴定  25-33
  2.1 引言  25
  2.2 实验材料与设备  25-27
    2.2.1 实验土壤样品及培养基  25
    2.2.2 主要化学试剂  25-26
    2.2.3 主要实验仪器  26-27
  2.3 实验方法  27-30
    2.3.1 土壤样品的预处理  27
    2.3.2 分散与差速离心法(DDC)  27
    2.3.3 筛选样品中产纤维素酶微生物的技术路线  27
    2.3.4 土壤样品中的微生物的分离培养  27-28
    2.3.5 M20的DNA提取  28-29
    2.3.6 M20 rDNA—ITS区PCR的引物扩增  29-30
  2.4 实验结果与讨论  30-32
    2.4.1 部分降解纤维素菌种  30-31
    2.4.2 降解纤维素菌种纤维素酶活力定性比较结果  31
    2.4.3 产纤维素酶菌种的鉴定结果  31-32
  2.5 本章小结  32-33
3 纤维素酶活测定与产酶条件优化  33-59
  3.1 引言  33
  3.2 实验材料与设备  33-35
    3.2.1 实验菌种及培养基  33-34
    3.2.2 主要化学试剂  34-35
    3.2.3 主要实验仪器  35
  3.3 实验方法  35-40
    3.3.1 纤维素酶活力定义  35-36
    3.3.2 DNS试剂的配制  36
    3.3.3 葡萄糖标准曲线的绘制  36
    3.3.4 DNS法测定纤维素酶活力  36-37
    3.3.5 M20摇瓶培养与发酵条件  37
    3.3.6 M20发酵产纤维素酶流程  37-38
    3.3.7 M8的摇瓶培养与发酵条件及产酶流程  38
    3.3.8 多因素对微生物摇瓶发酵产纤维素酶活性的影响  38-39
    3.3.9 发酵罐实验条件  39
    3.3.10 多因素对微生物上罐发酵产纤维素酶活性的影响  39-40
    3.3.11 纤维素酶水解反应过程中温度对酶活力影响  40
    3.3.12 纤维素酶水解反应过程中pH值对酶活力的影响  40
    3.3.13 纤维素酶的稳定性实验  40
  3.4 实验结果与讨论  40-57
    3.4.1 葡萄糖标准曲线的绘制结果  40-41
    3.4.2 发酵时间对纤维素酶活力的影响结果  41-44
    3.4.3 不同诱导物对微生物发酵产纤维素活力酶的影响结果  44-45
    3.4.4 发酵培养基初始pH值对M20产纤维素酶影响结果  45-46
    3.4.5 发酵温度对M20产纤维素酶影响结果  46-47
    3.4.6 不同的氮源对M20产酶活力大小的影响结果  47-48
    3.4.7 微晶纤维素的添加量对M20产纤维素酶活力影响结果  48-49
    3.4.8 发酵培养基成分的正交实验结果  49-51
    3.4.9 发酵时间对发酵罐实验pH值与FPA影响  51-52
    3.4.10 调控发酵罐pH实验结果  52-54
    3.4.11 发酵过程中的补料实验结果  54-55
    3.4.12 纤维素酶水解反应过程中温度对酶活力影响结果  55
    3.4.13 纤维素酶水解反应过程中pH值对酶活力的影响  55-56
    3.4.14 纤维素酶的稳定性实验结果  56-57
  3.5 本章小结  57-59
4 木质纤维素原料的水解  59-71
  4.1 引言  59
  4.2 实验材料与设备  59-60
    4.2.1 实验菌种及培养基  59
    4.2.2 主要化学试剂  59-60
    4.2.3 主要实验仪器  60
  4.3 实验方法  60-61
    4.3.1 木质纤维素原料的预处理  60
    4.3.2 M20发酵产纤维素酶  60-61
    4.3.3 DNS法分析M20纤维素酶水解落叶与草坪草生成还原糖含量  61
    4.3.4 还原糖标准曲线的绘制  61
    4.3.5 HPLC法分析M20纤维素酶水解木质纤维素原料生成的还原糖  61
  4.4 实验结果与讨论  61-69
    4.4.1 木质纤维素原料预处理结果  61
    4.4.2 M20发酵产纤维素酶的结果  61
    4.4.3 DNS分析M20纤维素酶水解落叶与草坪草生成还原糖含量结果  61-63
    4.4.4 还原糖标准曲线的绘制结果  63-65
    4.4.5 HPLC分析M20纤维素酶水解木质纤维素原料生成的还原糖结果  65-69
  4.5 本章小结  69-71
结论  71-72
展望  72-73
参考文献  73-78
附录Ⅰ M20ITS序列结果  78-79
攻读硕士学位期间发表学术论文情况  79-80
致谢  80-81

纤维素酶生产菌种的筛选鉴定与发酵产酶优化

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