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暗纹东方鲀与荷兰猪LIGHT及其受体HVEM的克隆、表达及功能的研究

作　者: 李春兰
导　师: 张双全
学　校: 南京师范大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 暗纹东方纯荷兰猪 LIGHT HVEM 荧光定量PCR 激光共聚焦
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

LIGHT是近年来发现的肿瘤坏死因子超家族第14个成员(TNFSF14)。在T细胞的共刺激下,能诱导肿瘤细胞凋亡,并且在自身免疫病、移植物抗宿主病(GVHD)以及抗肿瘤免疫等方面发挥重要作用。本实验室对暗纹东方纯LIGHT的克隆,表达及生物活性进行了研究。通过RT-PCR法,从暗纹东方纯(Takifugu obscurus)的脾脏组织中扩增得到765bp的mefugu LIGHT基因(简称fLIGHT)。 fLIGHT的开放阅读框(ORF)由254个氨基酸组成,其中胞外可溶段包含153个氨基酸。预测的三维结构显示fLIGHT与人,鼠LIGHT的结构相似。实时荧光定量PCR分析表明,fLIGHT主要在免疫组织中表达。我们在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达了重组可溶性SUMO-fsLIGHT和GFP-fsLIGHT蛋白,并对其进行SDS-PAGE和western blot分析鉴定。激光共聚焦观察显示fsLIGHT可以结合到小鼠淋巴细胞表面。体外MTT检测表明SUMO-fsLIGHT在anti-CD3共刺激下能够促进小鼠脾脏T淋巴细胞的增殖。本实验的研究结果表明LIGHT在鱼类中是能够强化免疫应答的免疫因子,可以为以后暗纹东方鲀免疫系统的研究提供-定的帮助。另外,我们还对荷兰猪LIGHT及受体HVEM的克隆,表达及生物信息学进行了分析。HVEM作为LIGHT的受体之一,是TNFRF家族的重要一员,在肿瘤免疫,炎症反应,自身免疫性疾病的发生及胸腺阴性选择等过程中发挥重要的生物学作用,鉴于两者对于免疫调节的重要作用,本实验选择实验动物荷兰猪(Cavia porcellus)作为研究对象。通过RT-PCR的方法,从荷兰猪的脾脏组织中分别扩增得到长度为726bp的LIGHT基因和861bp的HVEM基因。进而对这两个基因进行一系列的生物信息学分析,包括扩增的编码基因在基因组中的分布,蛋白三维结构的分析,两个蛋白相互作用的结合位点的预测以及与其他物种的同源关系分析。同时通过Real-time PCR对这两个基因在不同组织中的分布表达进行了分析。本实验还进行了LIGHT蛋白的表达,在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达了重组可溶性SUMO-gpsLIGHT蛋白,并对其进行SDS-PAGE和western blot分析鉴定。激光共聚焦观察显示gpsLIGHT可以结合到荷兰猪淋巴细胞和小鼠T细胞表面。本次研究对以后进一步研究LIGHT和HVEM提供了基础。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-6
前言  6-8
第一部分文献综述  8-26
  第一章 LIGHT的研究进展  9-21
    1.1 LIGHT的结构特点和组织分布  9-11
    1.2 LIGHT的受体  11-12
    1.3 LIGHT介导的信号通路  12-15
    1.4 LIGHT的生物学功能  15-18
    1.5 LIGHT与自身免疫疾病  18-19
    1.6 LIGHT与免疫治疗  19
    1.7 结论与展望  19-21
  第二章 HVEM的研究进展  21-26
    2.1 HVEM的分子结构及表达分布  21
    2.2 HVEM的配体  21-22
    2.3 HVEM的信号通路  22-24
    2.4 HVEM与疾病研究  24-25
    2.5 结语与展望  25-26
第二部分实验部分  26-61
  第三章暗纹东方纯LIGHT的克隆,表达,生物信息学分析及生物学活性研究  27-47
    3.1 实验材料  27-28
    3.2 实验方法  28-38
    3.3 实验结果与分析  38-45
    3.4 讨论  45-47
  第四章荷兰猪LIGHT及受体HVEM的克隆,表达及生物信息学分析  47-61
    4.1 实验材料  47-48
    4.2 实验方法  48-52
    4.3 实验结果  52-59
    4.4 讨论  59-61
全文总结  61-62
参考文献  62-70
附录：硕士在读期间研究成果  70-71
致谢  71

暗纹东方鲀与荷兰猪LIGHT及其受体HVEM的克隆、表达及功能的研究

内容摘要

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