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蚤状溞生殖转化相关功能基因Chk1和Hsp90的克隆与表达分析

作　者: 邹秀
导　师: 王丹丽
学　校: 宁波大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 蚤状溞 生殖转化 Chk1基因 Hsp90基因 克隆 表达
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


枝角类属于节肢动物门（Arthropoda）、甲壳纲（Crustacea）、鳃足亚纲（Branchiopoda）、双甲目（Diplostraca）、枝角亚目（Cladocera），是鱼类、虾蟹等许多水生动物的优良天然活饵料。近年来，随着我国水产养殖业的蓬勃兴起及苗种生产的不断发展，对枝角类的需求量越来越大，并需在不同季节保障充足供给。因此深入研究枝角类生殖发育规律，实现枝角类生长发育的人为调控在生产上具有广阔的应用前景。本研究以蚤状溞为研究对象，采用同源克隆和RACE-PCR的方法，克隆了蚤状溞Chk1和Hsp90基因的cDNA全长，利用Real-Time PCR技术分析了Chk1mRNA和Hsp90mRNA在蚤状溞不同生殖状态下的表达水平，旨在为研究枝角类生殖转化调控的分子机制提供理论基础。具体研究结果如下：（1）首次成功克隆了蚤状溞Chk1基因的cDNA全长，cDNA全长为1892bp，包含了一个311bp的5’-UTR区域和一个84bp的3’-UTR（非编码区）区域，其中包括一个终止密码子(TAA)和polyA尾。1497bp的开放阅读框（ORF）编码了498个氨基酸，Chk1蛋白N-末端包含一个“GxGxxG”ATP结合域，C-末端包含有6个SQ/TQ序列，是蛋白激酶激活域。同源性比对结果显示，蚤状溞Chk1基因与丽色扇头蜱的同源性最高为55%，其次是切叶蜂54%，顶切叶蚁53%、转基因捕食螨52%、欧洲熊蜂52%、豌豆长管蚜52%、黑腹果蝇51%；进化分析发现，蚤状溞Chk1蛋白与黑腹果蝇、顶切叶蚁等节肢动物的亲缘关系较近，与酿酒酵母、毕赤酵母等真菌的Chk1在分子进化上距离相对较远。（2）首次成功克隆了蚤状溞Hsp90基因的cDNA全长，cDNA全长为2568bp，包含了一个164bp的5’-UTR区域和一个249bp的3’-UTR（非编码区）区域，其中包括一个终止密码子(TAA)、多聚腺苷酸信号序列（ATTAAA）和polyA尾。2155bp的开放阅读框（ORF）编码了718个氨基酸，Hsp90蛋白中存在GxxGxG、LxxLL模块（亮氨酸拉链）和C末端的MEEVD序列。同源性比对结果显示蚤状溞Hsp90基因与日本对虾和刀额新对虾的同源性最高为85%，与其它甲壳纲物种的同源性保持在79%及以上。进化分析发现，蚤状溞Hsp90基因与剑水蚤、日本沼虾、红螯相手蟹等甲壳纲的亲缘关系最近。（3）用Real Time PCR技术，采用双内参基因进行相对定量，检测了Chk1mRNA在蚤状溞不同生殖状态下的表达水平：Chk1mRNA在两性溞（带冬卵）和孤雌溞（带夏卵）中的表达量有显著差异（P<0.05），推测Chk1可能参与了蚤状溞的生殖转化调控。Chk1mRNA在雄溞中的表达量是孤雌溞的2.5倍，说明Chk1基因很有可能在精子的形成过程中发挥重要作用。（4）用Real Time PCR技术，检测了Hsp90mRNA在蚤状溞不同生殖状态下的表达水平：Hsp90mRNA在两性溞（带冬卵）和孤雌溞（带夏卵）中的表达都有显著差异（P<0.05），且在冬卵中的表达量最低。Hsp90mRNA在两性溞（带冬卵）中的表达量明显高于孤雌溞（带夏卵），推测Hsp90可能参与了蚤状溞的生殖转化调控。Hsp90mRNA在雄溞中的表达量是孤雌溞的2.4倍，说明Hsp90可能参与了精子的形成过程。

全文目录


论文摘要  4-6
Abstract  6-11
引言  11
1 绪论  11-22
  1.1 枝角类生殖生物学研究概况  11-14
    1.1.1 枝角类生殖系统结构研究  11-13
    1.1.2 枝角类生殖转化的外界环境因子诱导研究  13
    1.1.3 枝角类生殖转化的内部调控机理研究  13-14
  1.2 细胞周期检测点激酶 1（checkpoint kinase 1，Chk1）的研究概况  14-17
    1.2.1 Chk1 的结构和功能  14-15
    1.2.2 Chk1 的研究现状  15-17
  1.3 热休克蛋白 90（Heat Shock Proteins 90,Hsp90）的研究概述  17-19
    1.3.1 Hsp90 的结构和功能  17-18
    1.3.2 Hsp90 的研究现状  18-19
  1.4 本文的研究目的和意义  19-22
2 蚤状溞 Chk1 基因全长 cDNA 的克隆  22-41
  2.1 实验材料和主要仪器  22-24
    2.1.1 实验溞来源及驯化  22
    2.1.2 主要试剂  22
    2.1.3 主要仪器  22-23
    2.1.4 引物序列  23
    2.1.5 测序  23
    2.1.6 主要溶液的配制  23-24
  2.2 实验方法  24-30
    2.2.1 蚤状溞总 RNA 的提取  24
    2.2.2 cDNA 第一链的合成  24-25
    2.2.3 蚤状溞 Chk1 基因目的片段的克隆  25
    2.2.4 感受态细胞的制备、目的片段的连接和转化  25-27
    2.2.5 RACE 扩增蚤状溞 Chk1 基因的全长序列  27-29
    2.2.6 蚤状溞 Chk1 基因的序列分析  29-30
  2.3 实验结果与分析  30-37
    2.3.1 蚤状溞总 RNA 提取及检测  30
    2.3.2 蚤状溞 Chk1 基因的特异性片段获取  30
    2.3.3 蚤状溞 Chk1 基因全长 cDNA 的克隆  30-31
    2.3.4 蚤状溞 Chk1 序列特征分析  31-34
    2.3.5 蚤状溞 Chk1 结构分析  34-35
    2.3.6 蚤状溞 Chk1 氨基酸序列同源性分析  35-37
  2.4 讨论  37-40
    2.4.1 蚤状溞的暂养  37-38
    2.4.2 蚤状溞总 RNA 的提取  38
    2.4.3 扩增目的片段兼并引物的设计  38-39
    2.4.4 蚤状溞 Chk1 基因的序列分析和系统发育分析  39-40
  2.5 本章小结  40-41
3 蚤状溞 heat shock protein 90（Hsp90）基因全长 cDNA 的克隆  41-54
  3.1 实验材料和主要仪器  41
    3.1.1 实验溞来源及驯化  41
    3.1.2 主要试剂  41
    3.1.3 主要仪器  41
    3.1.4 引物序列  41
    3.1.5 测序  41
    3.1.6 主要溶液的配制  41
  3.2 实验方法  41-43
    3.2.1 蚤状溞总 RNA 的提取  41
    3.2.2 cDNA 第一链的合成  41-42
    3.2.3 蚤状溞 Hsp90 基因目的片段的克隆  42
    3.2.4 感受态细胞的制备、目的片段的连接和转化  42
    3.2.5 RACE 扩增蚤状溞 Hsp90 基因的全长序列  42-43
    3.2.6 蚤状溞 Hsp90 基因的序列分析  43
  3.3 实验结果与分析  43-52
    3.3.1 蚤状溞 Hsp90 基因的特异性片段获取  43
    3.3.2 蚤状溞 Hsp90 基因全长的克隆  43-44
    3.3.3 蚤状溞 Hsp90 序列特征分析  44-47
    3.3.5 蚤状溞 Hsp90 结构分析  47-49
    3.3.6 蚤状溞 Hsp90 氨基酸序列同源性分析  49-52
  3.4 讨论  52-53
    3.4.1 蚤状溞 Hsp90 基因与生殖转化的关系  52
    3.4.2 蚤状溞 Hsp90 基因序列的分析和系统发育分析  52-53
  3.5 本章小结  53-54
4 Chk1 基因 mRNA 在蚤状溞不同生殖状态下的表达研究  54-63
  4.1 实验材料和主要仪器  54
  4.2 实验方法  54-56
    4.2.1 蚤状溞不同生殖状态的总 RNA 提取  54
    4.2.2 荧光定量 PCR 引物的设计  54-55
    4.2.3 荧光定量 cDNA 第一链的合成  55
    4.2.4 荧光定量 PCR 分析  55-56
    4.2.5 试验数据分析和公式  56
  4.3 实验结果与分析  56-59
    4.3.1 蚤状溞各生殖状态下样品的采集  56
    4.3.2 蚤状溞总 RNA 提取  56-57
    4.3.3 荧光定量 PCR 最佳内参基因的筛选  57
    4.3.4 荧光定量 PCR 最佳引物探索  57-58
    4.3.5 Chk1 mRNA 在蚤状溞各生殖状态下的表达差异  58-59
  4.4 讨论  59-62
    4.4.1 荧光定量样品的采集  59-60
    4.4.2 蚤状溞不同生殖状态下 Chk1 mRNA 的表达水平  60-62
  4.5 本章小结  62-63
5 Hsp90 基因 mRNA 在蚤状溞不同生殖状态下的表达研究  63-68
  5.1 实验材料和主要仪器  63
  5.2 实验方法  63
    5.2.1 蚤状溞不同生殖状态的总 RNA 提取  63
    5.2.2 荧光定量 PCR 引物的设计  63
    5.2.3 荧光定量 cDNA 第一链的合成  63
    5.2.4 荧光定量 PCR 分析  63
    5.2.5 试验数据分析和公式  63
  5.3 实验结果与分析  63-65
    5.3.1 荧光定量 PCR 最佳引物探索  63-64
    5.3.2 Hsp90 mRNA 在蚤状溞各生殖状态下的表达差异  64-65
  5.4 讨论  65-67
    5.4.1 蚤状溞不同生殖状态下 Hsp90 mRNA 的表达水平  65-66
    5.4.2 蚤状溞生殖转化的内外因分析  66-67
  5.5 本章小结  67-68
6 结论与创新点  68-70
  6.1 结论  68-69
  6.2 创新点  69-70
参考文献  70-76
在学研究成果  76-77
致谢  77

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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