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鱼藤素和冬凌草甲素靶向NPM1突变蛋白-治疗NPMc+急性髓系白血病作用机理研究

作　者: 易莎
导　师: 陈燕
学　校: 华中科技大学
专　业: 内科学
关键词: 鱼藤素 凋亡 分化 急性髓系白血病 NPM1突变 冬凌草甲素 急性髓系细胞白血病 Nup98 Crm1
分类号: R733.71
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


第一部分鱼藤素特异性下调NPM1突变蛋白促进NPMc+急性髓系白血病的凋亡及诱导分化目的：核磷蛋白(NPM1)是一种广泛存在于细胞核内的磷酸蛋白,穿梭于核仁、核质和胞浆之间,具有多种生物学功能。在接近1/3的急性髓系细胞白血病患者中,NPM1蛋白突变导致NPM1异常的胞浆聚集,是NPMc+AML发病的重要原因。本实验主要研究鱼藤素(deguelin)对急性髓系细胞白血病(AML)细胞OCI-AML3(具有NPM1蛋白突变)及OCIM2(NPM1野生型)的细胞凋亡,细胞分化,NPM1野生型蛋白,NPM1突变型蛋白的影响,探讨其抗肿瘤机制。方法：采用MTT比色法及台盼蓝染色法检测鱼藤素作用后AML细胞OCI-AML3及OCIM2细胞的增殖及活性；Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡；瑞氏-吉姆萨染色,CD11b,CD14分化抗原流式细胞术检测细胞分化；分光光度法检测Caspase-6和Caspase-8活性；Western blot免疫印迹技术检测凋亡相关蛋白PARP, Caspase3的表达,分化相关蛋白p53, p21, C/EBPa的表达以及NPM1总蛋白,野生型及突变型蛋白的表达水平；siRNA特异性沉默OCI-AML3细胞NPM1突变蛋白,检测OCI-AML3细胞增殖,细胞分化及分化相关蛋白的表达情况；结果：鱼藤素对NPMc+的AML细胞OCI-AML3具有明显抑制作用,可显著下调NPM1突变蛋白的表达,而冬凌草甲素,雷公藤内酯醇及白桦脂酸对OCI-AML3NPM1突变蛋白及野生型蛋白表达均无影响；在高浓度情况下,鱼藤素可明显促进OCI-AML3细胞的凋亡,OCI-AML2相对不敏感,OCI-AML3的凋亡伴随有Caspase-6,Caspase-8活性上调,NPM-mut蛋白特异性下调；而在低浓度情况下,鱼藤素则可诱导OCI-AML3细胞分化,对无NPM1突变OCIM2细胞无此作用,该分化作用可能与Caspase-8活性升高,p53, p21及30kD C/EBPa表达水平下降有关。SiNPM-mut沉默OCI-AML3,可抑制细胞增殖并促进细胞分化,并可下调p53,p21及30kD C/EBPa蛋白表达,激活Caspase-8活性。结论：与NPM1未突变急性白血病相比,OCI-AML3对鱼藤素最为敏感；高浓度鱼藤素能够明显抑制OCI-AML3细胞的增殖,并能诱导凋亡,这可能与NPM1突变蛋白的表达下调,Caspase-6, Caspase-8活性上调有关；而低浓度鱼藤素可特异性诱导OCI-AML3细胞的分化,该分化作用与NPM1突变蛋白下调,p53,p21及30kD C/EBPa蛋白表达,Caspase-8活性激活有关。第二部分冬凌草甲素对NPMc+急性髓系白血病NPM1突变蛋白异常定位的调节作用目的：本实验主要研究冬凌草甲素对NPMc+AML细胞OCI-AML3细胞增殖,细胞凋亡,核磷蛋白NPM1野生型,突变型蛋白表达及定位的影响,同时研究核孔蛋白98及Cml表达及定位情况,探讨其抗肿瘤机制。方法：采用MTT比色法检测冬凌草甲素作用后NPMc+细胞OCI-AML3的增殖活性,Annexin Ⅴ-FITC/PI双染法流式细胞术及Hoechst33258险测细胞凋亡,Western blot免疫印迹技术检测凋亡相关蛋白Caspase-3,PARP蛋白及p14arf、p53的表达,NPM1突变及野生型蛋白,Nup98, Crml表达水平和浆核分布情况；RT-PCR分别检测Nup98基因水平,免疫荧光共聚焦观察NPM1突变蛋白、NPM1野生型蛋白和Nup98的亚细胞定位和表达。结果：冬凌草甲素能明显抑制NPMc+OCI-AML3细胞的增殖,其抑制作用呈时间、剂量依赖性；能诱导细胞凋亡；促进NPM1突变蛋白向胞核转位；上调p14arf及p53的表达；经冬凌草甲素干预后,OCI-AML3细胞Nup98mRNA及蛋白水平均明显上调,并伴有明显的Nup98核内转位；冬凌草甲素对Crm1蛋白表达无影响,可使其向核内转位；结论：冬凌草甲素能够明显抑制NPMc+细胞OCI-AML3的增殖,并能诱导凋亡；通过上调OCI-AML3细胞Nup98的表达从而使得Cml滞留于胞浆,降低NPM1突变蛋白的核外转运,稳定p14arf及p53的表达,这可能是冬凌草甲素抗NPMc+急性髓系白血病作用的机制之一。

全文目录


英文缩略词简表  6-8
中文摘要  8-11
ABSTRACT  11-14
前言  14-19
  参考文献  16-19
第一部分 鱼藤素特异性下调NPM1突变蛋白促进NPMc+急性髓系白血病的凋亡及诱导分化  19-48
  材料与方法  19-27
  结果  27-42
  讨论  42-44
  参考文献  44-48
第二部分 冬凌草甲素对NPMc+急性髓系白血病NPM1突变蛋白异常定位的调节作用  48-68
  材料与方法  48-53
  结果  53-63
  讨论  63-65
  参考文献  65-68
综述  68-80
  参考文献  74-80
致谢  80-81
附录1 攻读博士学位期间发表文章与会议报告  81-83
附录2 已发表文章全文  83-94

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 造血器及淋巴系肿瘤 > 白血病 > 急性白血病
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