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少突胶质细胞凋亡与海洛因海绵状白质脑病发病机制的研究

作　者: 陈强
导　师: 陆兵勋
学　校: 南方医科大学
专　业: 神经病学
关键词: 海洛因海绵状白质脑病病理染色免疫组化少突胶质细胞凋亡意识障碍
分类号: R749.6
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

【背景与目的】海洛因海绵状白质脑病(Heroin Spongiform Leucoencephalopathy，HSLE)是一种与烫吸海洛因有关的脑白质病。该病在世界上首先由Wolters E等于1982年在荷兰阿姆斯特丹报道47例，其特征为：1)经鼻烫吸海洛因后发病；2)临床上以小脑受损为突出表现3)影像表现大脑、小脑白质的广泛对称性改变4)病理改变以脑白质海绵状空泡变性为其特征。此后，德国、美国、比利时、意大利、瑞士、挪威、西班牙以及台湾地区等地也相继报道多起个案。2000年广东地区出现了经鼻吸食海洛因之后出现的以小脑、锥体束受损为主要临床表现的病例，并由陆兵勋等最先报道了28例确诊为HSLE的患者，此为中国大陆首次出现并成批爆发，因其临床表现、影像学改变和病理改变均与荷兰学者报道相似，陆兵勋等认为是该病在世界范围内的第二次爆发流行。因其发病与烫吸海洛因有关，脑白质病理呈海绵状改变，因而诊断为海洛因海绵状白质脑病。HSLE不同于已知的各种海洛因相关性脑病，也不同于其他代谢性脑海绵状改变的疾病。HSLE具体的病因以及发病机制目前不明，相关的病理研究资料非常有限并且各家报道的结果并非完全一致。为此，本研究试图在我们既往研究本病的病理基础上进行更深一步的研究，并结合动物实验和临床来揭示HSLE的发病机制。为了了解HSLE的发病机制，本文分别进行了海洛因杂质提取物和海洛因的SD大鼠熏蒸实验，用双环己酮草酰二腙诱导出海绵状白质空泡变性的SD大鼠实验模型，发现细胞凋亡这一新的研究线索。在此基础之上，通过对HSLE少突胶质细胞凋亡的研究和凋亡机制的探讨，分析HSLE意识障碍及与急性海洛因中毒性脑病的临床研究，综合说明HSLE的发病机制。【材料与方法】所有60只SD大鼠均由南方医科大学动物中心提供。一组：30只SD大鼠，体重200—220克，雌雄各半，随机分为三组，分别采用从海洛因样品中检测出的杂质异烟肼、安定、巴比妥和滑石粉作为实验组，市售海洛因作为海洛因组，每日熏蒸1次，每次20分钟，共两周。取鼠脑，进行H．E染色，观察脑白质有无异常改变。二组30只4—6周180—200克SD大鼠，雌雄各半，随机分为实验4周和6周二组，予2％双环己酮草酰二腙混悬液，10mg／100克体重／24小时，经口腔食管灌胃，1次／日。对照组予等剂量生理盐水灌胃，共6周。鼠脑标本分别进行H．E染色，hoechst33258细胞凋亡染色，caspase-3 RT-PCR和髓鞘电镜观察。收集2000年3月至2004年4月南方医院剖检的HSLE脑标本4例，年龄26—38岁，对照2例，年龄54和66岁，通过免疫组化法进行Taul，Tau3和MAP2微管蛋白的研究。对2000年3月至2004年4月南方医院剖检的HSLE脑标本4例，年龄26—38岁，和5例对照脑标本，年龄54-80岁。取材额叶，小脑和胼胝体，分别进行H．E，K．B染色。GFAP，MBP，COX-2，CNPase，Caspase-3免疫组化染色；免疫荧光染色；TUNEL细胞凋亡检测和髓鞘电镜检查。结合显微图像分析仪进行定量分析。将2000年3月至2006年10月在南方医院住院的39例HSLE患者进行临床分析，找出其中出现意识障碍的患者，分为意识障碍组与非意识障碍组进行比较，并将意识障碍组与同期6例急性海洛因中毒性脑病进行临床对比分析。【结果】海洛因杂质提取物实验及市售海洛因大鼠熏蒸实验，脑组织大体病理未见明显异常，切开见脑皮质结构完整，灰白质界线分明，H．E染色未见白质有空泡样改变形成。双环己酮草酰二腙灌注法实验性SD大鼠脑白质空泡样改变结果：部分脑膜与颅骨之间有轻度粘连，脑表面颜色灰白，切面灰白质分界清楚，小脑半球灰白质结构清晰，脑白质区无扩大。电镜：髓鞘板层内有空泡形成，多部位髓鞘被涡轮状空泡所裂解。H．E染色：6周组中10例大鼠中有7例在脑干出现空泡样改变，大脑白质深层有4例出现白质空泡样变；4周组均未见异常。小脑白质均未见空泡样改变。hoechst33258细胞凋亡染色：在实验组4周有7例脑干和5例大脑深层白质6周有7例脑干和6例大脑深层白质见有细胞核荧光着色的阳性凋亡细胞。对照细胞核未见DNA阳性改变。Caspase-3RT—PCR显示四周时见部分表达，而到第六周显示表达明显。免疫组化微管相关蛋白：Taul，Tau3和MAP2微管蛋白在HSLE未见明显的阳性表达。4例HSLE脑标本检查H．E染色：HSLE小脑白质结构呈明显大小不等的空泡样改变，与对照相比可见各层结构已有所破坏，由浅层白质向深层白质过渡空泡样改变越加明显。对照额叶灰白质交界处染色，显示灰白结构分明，而HSLE额叶灰白交界处染色，可见白质明显空泡形成，结构散乱，但U型纤维相对完整。MBP免疫组化：免疫组化MBP染色HSLE与对照深层白质MBP灰度值比较(t=3.93，P=0.011)，具有显著性差异。HSLE深层白质与浅层白质和灰质的灰度值比较(t=4.587，P=0.006：t=5.412，P=0.003)，均具有显著性差异。GFAP免疫组化：GFAP免疫组化染色可见星形胶质细胞在HSLE病灶区的两个显著性特征改变：1，在病灶边缘地带可见星形胶质细胞成簇积聚，与对照星形胶质细胞均匀分布形成明显差异。2，在病灶中心区域，星形胶质细胞较对照相对少，但可见星形胶质细胞在细胞胞体上明显增大，细胞周围有明显的浓染颗粒。HSLE组白质深层与白质浅层相比有显著性差异(t=23.43，P=0.000)；对照组白质深层与HSLE组白质深层相比有显著性差异(t=22.88，P=0.000)；对照组白质浅层与HSLE组白质浅层相比有显著性差异(t=10.16，P=0.000)。显示HSLE病灶区星形胶质细胞有肥大无增生的改变特征。免疫组化caspase-3染色：免疫组化染色可见HSLE病灶区胞浆黄褐色的Caspase-3蛋白阳性的少突胶质细胞，与对照比较两者具有显著性差异(t=10.38，P=0.000)。Caspase-3蛋白阳性分布以浅层白质髓鞘轻度改变处为最明显，深层白质有少量Caspase-3蛋白阳性的少突胶质细胞出现。TUNEL凋亡细胞检测：HSLE白质可见少突胶质细胞凋亡，深层白质可见凋亡小体，表现为细胞核着色，部分核浓缩，小脑、胼胝体、额叶白质均有少突胶质细胞凋亡表达，(细胞数均数加减标准差分别为8.08±4.42；12.83±5.20；12.92±4.80)明显高于对照组(P=0.000)。免疫荧光双标染色：COX-2+Caspase以及CNPase+Caspase，均可见黄色双重染色阳性标记。表明凋亡以及COX-2的改变是发生在少突胶质细胞。COX-2免疫组化染色：胞浆呈黄棕色或红褐色的COX-2阳性表达，HSLE的小脑、额叶、胼胝体白质COX-2阳性细胞数均数加减标准差分别为12.83±3.81，15.33±4.81，和13.08±5.28，与对照1.42±1.16，0.83±0.94，0.58±0.67相比明显增高，并有显著性差异(t值分别为11.74，9.45和7.85，P=0.000)。CNPase免疫组化染色：胞浆呈黄棕色或褐色。对照组小脑、额叶、胼胝体白质CNPase阳性细胞数均数加减标准差分别为：16.75±5.88：17.42±4.08：17.67±3.77。HSLE的小脑、额叶、胼胝体白质CNPase阳性细胞数分别为：12.50±5.39：13.08±4.14：12.75±4.03，阳性表达较对照减少(t=2.219，P=0.048；t=2.229，P=0.048和t=3.335，P=0.007)。COX-2／CNPase表达分析：CNPase与COX-2表现相反，在病灶区的表达明显下调，使得HSLE表现出显著的COX-2表达上调和CNPase表达下调改变特征。HSLE意识障碍与非意识障碍临床分析：常规检查，意识障碍组除血浆蛋白较非意识障碍组减低外，脑脊液检查无明显区别。意识障碍组所有患者均表现出中度—重度脑电图的异常，尤为明显的是3例入院时意识清楚但逐渐进展致浅昏迷的患者，显示出高度异常的脑电图表现，非意识障碍组仅10％有轻度异常，两组间差别显著。影像改变：非意识障碍组患者病灶受累的范围明显小于意识障碍组。通过表格计算得出：意识障碍组(?)±s=70.09±39.65；非意识障碍组(?)±s=41.79±11.40。两组相比较t=3.427，P=0.005，显示两组之间有统计学差异。SPECT脑灌注显像表现为白质为主的放射性稀疏。非意识障碍组主要表现为大脑后纵裂枕叶低灌注显像，呈对称性；而意识障碍组表现为大，小脑白质区均扩大，呈放射状稀疏或缺损，脑灰质区见多发低血供灶。HSLE意识障碍与急性海洛因中毒性脑病：急性海洛因中毒性脑病有很高的并发感染的概率，但两组生化检查相差不大。在血气分析检查上，急性海洛因中毒性脑病较HSLE有更多的异常表现。脑电图检查；两组均以弥漫性慢波活动为主，呈中—重度异常改变。MRI检查：HSLE表现为双侧大脑半球，小脑，胼胝体，脑干，内囊后肢，半卵圆中心，放射冠白质的广泛，对称性的长T1，长T2改变。急性海洛因中毒性脑病的影像改变则表现为弥漫性脑肿胀或灰质神经核团受累征象，并合并有局灶性同时累计灰白质的改变。转归：HSLE意识障碍组9例患者死亡6例，急性海洛因中毒性脑病6例患者无死亡病例。【结论】1、S-D大鼠用灌注法给与双环己酮草酰二腙，可以诱导出脑白质空泡样改变动物模型，该白质空泡样改变与白质内细胞凋亡有密切联系。从海洛因杂质中分离出的异烟肼、安定、巴比妥和滑石粉给与SD大鼠两周的熏蒸实验不能诱导出白质空泡样改变的动物模型。2、HSLE不是神经系统变性疾病。3、HSLE海绵状白质广泛变性，病灶区发现大量少突胶质细胞凋亡，尤以病灶边缘部位明显。CNPase下调／COX-2上调导致少突胶质细胞凋亡。COX-2抑制剂消炎痛可以用于HSLE患者的治疗。4、脑电图异常是海洛因海绵状白质脑病患者发生意识障碍改变的重要异常表现；海洛因海绵状白质脑病患者病灶范围的大小与能否出现意识障碍密切相关；脑局灶性的低灌流，尤其是在灰质的低灌流可能是引起抽搐，进而导致意识障碍的原因之一。HSLE意识障碍者表现为双侧大脑半球，小脑，胼胝体，内囊后肢，半卵圆中心，放射冠白质的广泛，对称性的长T1，长T2改变。急性海洛因中毒性脑病的影像改变则表现为弥漫性脑肿胀或灰质神经核团受累征象，并合并有局灶性同时累计灰白质的改变，HSLE发生意识障碍较急性海洛因中毒性脑病有更高的病死率。

全文目录

中文摘要  3-9
ABSTRACT  9-19
前言  19-24
第一章海绵状白质改变大鼠模型的建立和鼠脑白质海绵状改变机制探讨  24-52
  材料与方法  26-35
  结果  35-41
  讨论  41-47
  结论  47-52
第二章微管相关蛋白改变与海洛因海绵状白质脑病发现机制研究  52-68
  材料与方法  54-59
  结果  59-62
  讨论  62-64
  结论  64-65
  参考文献  65-68
第三章少突胶质细胞凋亡引起海洛因海绵状白质脑病  68-97
  材料与方法  69-79
  结果  79-88
  讨论  88-93
  结论  93-94
  参考文献  94-97
第四章海洛因海绵状白质脑病意识障碍的临床分析  97-125
  前言  97
  第一节海洛因海绵状白质脑病患者意识障碍与非意识障碍的临床分析  97-105
    材料与方法  97-103
    结果  103-105
    结论  105
  第二节海洛因海绵状白质脑病意识障碍与急性海洛因中毒性脑病意识障碍的临床分析  105-125
    材料与方法  105-111
      2.1 材料  105-106
      2.2 方法  106-110
      2.3 结果  110-111
    讨论  111-112
    综合讨论  112-122
    参考文献  122-125
综述  125-135
附录 (缩略词表)  135-136
在读博士期间撰写和发表的论文  136-137
致谢  137-139

少突胶质细胞凋亡与海洛因海绵状白质脑病发病机制的研究

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