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反义寡核苷酸对培养的视神经少突胶质细胞Nogo-A调控的实验研究

作　者: 彭锡嘉
导　师: 刘少章；叶剑
学　校: 第三军医大学
专　业: 眼科学
关键词: Nogo-A 少突胶质细胞反义寡核苷酸细胞培养
分类号: R774.6
类　型: 硕士论文
年　份: 2002年
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内容摘要

背景与目的：视神经损伤是常见的一类眼外伤。在颅脑损伤中，视神经损伤发生率为0.3%～5.2%。视神经损伤后预后不良，约有40～50%的患者失明。目前临床上尚缺乏有效的治疗手段。周围神经损伤后可再生。传统的观点认为中枢神经受损后不能再生。视神经再生失败的原因除了与其神经元-RGCs（retinal ganglion cells）再生能力低下、营养因子缺乏有关外，其微环境中存在着神经生长抑制因子也是一个重要因素[1]。Schwab等研究发现少突胶质细胞表达的神经生长抑制因子NI-35/250对中枢神经的再生具有强烈的抑制作用[1-9、12]。2000年初，科学家发现抑制神经再生基因-Nogo[13-22]。其转录的mRNA有三种：Nogo-A，B和C。其中Nogo-A mRNAb编码蛋白NI-250，仅表达于少突胶质细胞。近年来的许多研究表明，利用NI-250的单克隆抗体IN-1可中和其抑制作用，促进中枢神经再生[9、10]。但利用反义技术来抑制或封闭抑制神经再生基因表达尚未见报道。本实验的目的：检测神经生长抑制因子Nogo-A在培养的少突胶质细胞的表达；研究反义寡核苷酸对Nogo-A表达的影响，筛选出安全有效的浓度为在体研究奠定基础。方法：实验分为3个部分：(一)用新生2天的Wistar大鼠视神经直接接种，通过调整培养基获得少突胶质细胞。通过GC抗体免疫染色对培养的细胞进行鉴定。(二)使用地高辛标记的探针，利用原位杂交方法检测少突胶质细胞Nogo-A mRNA的表达。(三)荧光倒置显微镜下观察细胞对6-FAM标记Nogo-A 反义寡核苷酸的摄取情况；应用RT-PCR检测对照组、随机序列和三种Nogo-A 反义寡核苷酸浓度组（2μM、5μ(M、10μM）Nogo-A mRNA的表达变化。<WP=8>结果：1.视神经组织接种后3天,有圆形或梭形的细胞自视神经迁出；11天左右，细胞基本铺满盖玻片；GC抗体免疫组化显示获得的细胞为少突胶质细胞。2.原位杂交显示Nogo-A mRNA阳性表达的细胞胞浆呈棕黄色阳性反应，阴性对照实验呈阴性反应。3.荧光倒置显微镜下观察，80%以上的细胞呈绿色荧光；RT-PCR结果显示三种浓度（2μM、5μM、10μM）的Nogo-A 反义寡核苷酸组，Nogo-A mRNA的表达均显著降低（P<0.01）。随机序列对Nogo-A mRNA的表达无影响（P>0.05）。10μM以下的浓度对存活无明显影响。结论：本课题建立的少突胶质细胞培养方法，可获得纯化的少突胶质细胞，能满足进一步的实验需要；少突胶质细胞表达Nogo-A mRNA；少突胶质细胞能直接摄取反义寡核苷酸；Nogo-A反义寡核苷酸可有效地、特异性地抑制靶基因的表达。10μM以下的浓度对存活无明显影响。

全文目录

中英文缩写  4-5
英文摘要  5-7
中文摘要  7-9
论文全文反义寡核苷酸对培养的视神经少突胶质细胞 Nogo-A表达调控的实验研究  9-33
  前言  7-10
  实验一视神经少突胶质细胞的体外培养及鉴定  10-15
    材料和方法  10-13
    结果  13
    讨论  13-15
  实验二视神经少突胶质细胞Nogo-AmRNA的表达  15-19
    材料和方法  15-17
    结果  17
    讨论  17-19
  实验三反义寡核苷酸对少突胶质细胞Nogo-A表达的影响  19-33
    材料和方法  19-27
    结果  27-29
    讨论  29-32
    结论  32-33
致谢  33-34
照片说明  34-41
参考文献  41-46
文献综述1 反义技术研究进展  46-56
  参考文献  53-56
文献综述2 少突胶质细胞与视神经再生  56-67
  参考文献  63-67
在读期间发表论文  67

反义寡核苷酸对培养的视神经少突胶质细胞Nogo-A调控的实验研究

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