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siRNA干扰急性早幼粒细胞白血病细胞增殖和凋亡的体外实验研究

作　者: 罗海希
导　师: 曹献英; 郝新宝
学　校: 海南大学
专　业: 生物化工
关键词: 急性早幼粒细胞白血病 NB4细胞 siRNA 增殖 凋亡
分类号: R733.71
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


以急性早幼粒细胞白血病NB4细胞PML-RARa为靶基因设计相应的siRNA,并探究PML-RARαsiRNA对NB4细胞增殖和凋亡的影响,为siRNA潜在的抗急性早幼粒细胞白血病的临床应用提供理论基础和实验依据。在GeneBank上查找PML-RARa基因全序列,用MPI规则和理性设计原则对靶基因序列进行初步筛选,并对候选靶mRNA进行二级结构预测和热动力学参数分析,通过BLAST分析排除与其它基因有高度同源性的序列。筛选出来的siRNA序列和阴性对照序列分别转染NB4细胞。采用MTT比色法和软琼脂细胞克隆实验检测(?)siRNA对体外培养的NB4细胞的增殖抑制作用。用流式细胞术测定细胞凋亡,并用Giemsa-Wright染色观察细胞的凋亡形态。利用Western blot检测(?)siRNA各序列作用NB4细胞后PML-RARa融合蛋白表达水平的变化。利用各项规则筛选出了5条可能高效的PML-RARa siRNA,并委托生物公司化学合成。5条siRNA中,siRNA124、siRNA1246、siRNA1690在浓度为12.5nmol/L-50nmol/L时转染细胞24h、48h和72h后都明显的抑制NB4细胞的增殖。siRNA1244、siRNA1246、 siRNA169024h IC50分别为46.578nmol/L,59.324nmol/L,62.620nmol/L;48h IC50分别65.668nmol/L,76.549nmol/L,74.430nmol/L。软琼脂细胞集落形成实验进一步证明了siRNA对NB4细胞增殖的抑制作用。用流式细胞术检测细胞凋亡显示siRNAs(siRNA30、 siRNA382、siRNA1244、siRNA1246和siRNA1690,24h)转染NB4细胞的特异性凋亡率分别为1.53%、15.26%、64.50%、57.53%和21.46%。对NB4细胞进行Giemsa-Wright染色,在光镜下可观察到细胞皱缩、凋亡小体等。Western blot实验结果显示siRNAs (siRNA1244、siRNA1246和siRNA1690)分别转染NB4细胞后其PML-RARa融合蛋白表达下调。研究中设计的siRNAs (siRNA1244、siRNA1246和siRNA1690)在一定的浓度范围内可以有效的抑制人急性早幼粒细胞白血病NB4细胞的增殖,具有浓度依赖性；siRNAs在50nmo1/L条件下能够有效诱导人急性早幼粒细胞白血病NB4细胞明显凋亡；相应的siRNA在50nmol/L浓度下下调了NB4细胞PML-RARa融合蛋白的表达水平；筛选出siRNA1244、siRNA1246和siRNA1690这3条PML-RARa siRNA可以在蛋白水平抑制PML-RARα基因的表达,显著的抑制NB4细胞的增殖,并有效的诱导细胞凋亡。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-10
综述  10-18
  1 急性早幼粒细胞白血病的发病机制和治疗现状  10-13
    1.1 早幼粒细胞白血病发病的分子基础  10
    1.2 早幼粒细胞白血病的化学治疗  10-11
    1.3 早幼粒细胞白血病的诱导分化治疗  11-12
    1.4 早幼粒细胞白血病的免疫治疗  12-13
    1.5 早幼粒细胞白血病的基因治疗  13
  2 RNA干扰技术与肿瘤治疗  13-16
  3 研究的意义和内容  16-18
一、靶向PML-RAR α mRNA siRNA的设计与合成  18-30
  1 材料  18
  2 实验方法  18-21
    2.1 PML-RARα基因序列的获取与siRNA的设计  18-20
    2.2 siRNA的特异性检测  20-21
    2.3 siRNA的合成  21
  3 结果  21-26
    3.1 初步筛选的siRNA序列  21-24
    3.2 siRNA的热力学特点  24-25
    3.3 靶位点的二级结构以及siRNA的同源性比对  25-26
  4 讨论  26-30
二、siRNA对NB4细胞存活和凋亡的影响  30-55
  1 材料  30-34
  2 实验方法  34-37
    2.1 siRNA转染细胞  34
    2.2 NB4细胞增殖活性的检测  34-35
    2.3 测定NB4细胞的凋亡  35
    2.4 融合蛋白表达的检测  35-37
    2.5 统计学分析  37
  3 结果  37-50
    3.1 siRNA在NB4细胞中的转染效率  37-38
    3.2 不同浓度的siRNA对NB4细胞抑制与诱导凋亡的作用  38-48
    3.3 NB4细胞的形态学变化  48-50
    3.4 siRNA下调NB4细胞PML-RARα融合蛋白表达水平  50
  4 讨论  50-55
三、结论  55-56
参考文献  56-61
发表论文  61-62
致谢  62

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 造血器及淋巴系肿瘤 > 白血病 > 急性白血病
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