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泥蚶大规模死亡的病原生物学及其宿主血细胞免疫特性研究

作　者: 朱泽闻
导　师: 吴信忠
学　校: 浙江大学
专　业: 特种经济动物饲养
关键词: 泥蚶 血细胞 显微结构 酶活性 吞噬活性 颗粒细胞 透明细胞 RLO 包涵体 大量死亡 流行病学 天冬氨酸消旋酶
分类号: S944.44
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


泥蚶是重要的养殖经济贝类,但近年来泥蚶病害问题日益突出,大规模死亡频繁发生,造成较大损失。查明大规模死亡病因,加强泥蚶病害免疫预防研究,对促进泥蚶养殖业健康发展、丰富贝类免疫学理论具有重要意义。本研究采用光镜、电镜、流式细胞仪、分子生物学、细胞生物学、生物信息学等技术,对乐清湾泥蚶大规模死亡原因进行了流行病学调查,并对泥蚶血细胞免疫特性以及血淋巴中免疫相关的天冬氨酸消旋酶基因进行了研究。1.2005年至2009年乐清湾养殖泥蚶多次发生大量死亡。一种专性寄生于细胞内的原核微生物,在濒死和死亡的泥蚶中多次被检测到。这些原核微生物通常呈圆形、椭圆形或哑铃形；大小在0.28μm和0.71μm之间；为三层细胞膜结构；具有横二分裂和出芽两种繁殖方式。这种原核微生物能形成细胞内嗜曙红性的包涵体。这些包涵体主要分布于外套膜、鳃、消化管的上皮组织和结缔组织中。根据生物学和形态学特点,推测该原核微生物属于立克次氏体科,定名为类立克次氏体(RLO)。这种RLO表现出较强的致病性。病理学检查发现被RLO感染的细胞呈现严重的病理变化；组织的破坏程度与RLO包涵体的数量正相关；细胞病变程度与细胞内RLO数量正相关；具有相似特征的RLO及其包涵体,在不同养殖场、不同发病时间所采集的泥蚶病样中都有发现；RLO感染强度与泥蚶死亡率正相关。为此,认为RLO感染与乐清湾养殖泥蚶大量死亡有密切联系。2.根据细胞大小、形态结构、颗粒特点,光镜下可将泥蚶血细胞区分为红色颗粒细胞(占89.67%)、嗜碱性颗粒细胞(占7.05%)、透明细胞(占3.28%)三种主要类型。健康泥蚶血淋巴中血细胞平均密度为3.29±0.82×106cell/mL。透射电镜下观察到颗粒细胞Ⅰ型、颗粒细胞Ⅱ型、无颗粒细胞；扫描电镜观察下,细胞表面光滑,部分细胞表面有小的突起物。用流式细胞仪检测出P1(13.13%)和P2(78.83%)两个细胞亚群以及没有固定形态的细胞(近8%)。利用APIZYM试剂盒对健康泥蚶血细胞及血清中的19种酶进行检测,在血细胞中检测到11种酶,在血清中检测到了13种酶,经酵母聚糖刺激后,碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、类脂脂酶、N-乙酰葡萄糖胺酶在血细胞和血清中水平大幅升高。体外吞噬实验揭示红色颗粒细胞对酵母聚糖具有明显的吞噬能力,嗜碱性颗粒细胞和透明细胞吞噬作用不显著；在经嗜水气单胞杆菌刺激后,嗜碱性颗粒细胞出现大量聚集现象,透明细胞能吸附颗粒物。吞噬活性研究表明,温度、盐度对泥蚶血细胞的吞噬活性有显著的影响,在泥蚶适宜生长温度(13-30℃)区间和最适盐度(20.0-26.2ppt)区间,血细胞吞噬活性达到最高值。3.从泥蚶血细胞中克隆出天冬氨酸消旋酶(AR)基因,泥蚶AR基因的ORF序列全长1017bp,编码338个氨基酸,预测蛋白分子量为37.1kDa,理论等电点为8.62,为碱性蛋白。序列分析发现,泥蚶氨基酸序列与魁蚶AR氨基酸序列的同源性达到93%,与海胆和海鞘的AR氨基酸序列同源性为51%和41%。聚类分析表明,泥蚶AR能与所有已报道的生物AR聚合在一起,表明成功克隆了泥蚶天冬氨酸消旋酶的基因。泥蚶AR含有5-磷酸毗哆醛(PLP)结合模序,提示其活性需要PLP的存在。AR基因在泥蚶血细胞中表达,表明AR和D型天冬氨酸可能参与泥蚶血细胞的免疫机制。

全文目录


摘要  6-8
Abstract  8-15
引言  15-16
第一部分 文献综述及研究内容与技术路线  16-53
  第一章 泥蚶生物学研究综述  17-25
    1 地理分布和生活习性  17-18
    2 形态和生长特性  18-20
    3 繁殖生物学研究  20-21
    4 人工育苗和增养殖学研究  21-22
    5 种质资源保护研究  22-23
    6 病害及免疫功能研究  23
    7 生物利用研究  23-24
    8 研究展望  24-25
  第二章 水生动物类立克次体研究综述  25-40
    1 类立克次体病害  26-29
      1.1 类立克次体的形态、特征  26
      1.2 致病机制  26-27
      1.3 类立克次体的分类  27-29
    2 主要水生动物的类立克次体感染  29-34
      2.1 贝类类立克次体的感染  29-32
      2.2 鱼类类立克次体的感染  32-33
      2.3 甲壳类类立克次体的感染  33-34
    3 类立克次体的研究方法  34-37
      3.1 组织培养方法  34
      3.2 电子显微镜技术  34-35
      3.3 生物化学方法  35
      3.4 免疫学方法  35-36
      3.5 分子生物学方法  36-37
    4 类立克次氏体与贝类的相互作用  37-39
    5 研究展望  39-40
  第三章 贝类血细胞免疫防御机制研究综述  40-50
    1 贝类血细胞类型  40-46
    2 血细胞免疫防御机制  46-48
      2.1 吞噬作用  46-47
      2.2 包囊作用  47
      2.3 识别机制  47-48
      2.4 其他防御功能  48
    3 环境因子对血细胞免疫防御的影响  48
    4 研究展望  48-50
  第四章 研究内容及技术路线  50-53
    1 研究内容  50-51
    2 技术路线  51-53
第二部分 养殖泥蚶规模死亡病原生物学研究  53-74
  第五章 乐清湾发病泥蚶中类立克次氏体的鉴定  54-68
    1 材料与方法  54-56
      1.1 采样及样品处理  54-55
      1.2 组织病理染色  55
      1.3 透射电镜观察  55-56
    2 结果  56-66
      2.1 临床症状  56-57
      2.2 包涵体的形态描述  57-61
      2.3 超微形态描述  61-65
      2.4 病理描述  65-66
    3 讨论  66-68
      3.1 泥蚶中原核微生物的鉴定  66-67
      3.2 RLO感染的致病性  67-68
  第六章 类立克次氏体感染与泥蚶大量死亡的相关性研究  68-74
    1 材料和方法  68-69
      1.1 流行病学调查和采样  68-69
      1.2 组织病理染色  69
      1.3 感染率和感染强度  69
      1.4 相关性分析  69
    2 结果  69-73
      2.1 死亡率  69-72
      2.2 死亡率与RLO感染相关性分析  72-73
    3 讨论  73-74
      3.1 环境因子对RLO感染致病性的影响  73
      3.2 泥蚶大量死亡与RLO感染的相关性分析  73-74
第三部分 泥蚶血细胞免疫特性的研究  74-92
  第七章 泥蚶血细胞类型及功能研究  75-87
    1 材料与方法  75-77
      1.1 实验动物及血淋巴  75-76
      1.2 血细胞活体观察及计数  76
      1.3 血涂片及Giemsa染色观察  76
      1.4 透射电镜和扫描电镜观察  76
      1.5 流式细胞仪  76-77
      1.6 血细胞吞噬实验  77
    2 结果  77-80
      2.1 血细胞光镜观察及计数  77-78
      2.2 超微结构观察  78-79
      2.3 流式细胞仪  79
      2.4 吞噬实验中血细胞观察  79-80
    3 讨论  80-87
      3.1 泥蚶血细胞分类和数量  80-81
      3.2 泥蚶血细胞免疫功能  81-87
  第八章 泥蚶血细胞免疫性能研究  87-92
    1 材料与方法  87-88
      1.1 实验动物及血淋巴  87
      1.2 血淋巴中酶的测定  87
      1.3 血细胞吞噬性能的研究  87-88
        1.3.1 盐度对吞噬率的影响  87-88
        1.3.2 温度对吞噬率的影响  88
      1.4 数据统计  88
    2 结果  88-90
      2.1 血淋巴酶的测定  88-89
      2.2 血细胞的吞噬活性  89-90
    3 讨论  90-92
      3.1 泥蚶血淋巴的酶活性  90-91
      3.2 血细胞吞噬活性  91-92
第四部分 泥蚶天冬氨酸消旋酶基因鉴定与序列分析  92-106
  第九章 泥蚶天冬氨酸消旋酶基因鉴定与序列分析  93-106
    1 材料与方法  94-99
      1.1 材料  94-95
      1.2 方法  95-99
    2 结果  99-105
      2.1 总RNA的检测及鉴定  99
      2.2 基因鉴定  99-100
      2.3 序列分析  100-105
    3 讨论  105-106
全文小结  106-108
参考文献  108-127
攻读博士学位期间研究成果及发表论文  127-129
个人简历  129-130
致谢  130

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