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捻转血矛线虫磷酸丙糖异构酶基因克隆、表达、酶活性分析及重组谷氨酸脱氢酶活性测定

作　者: 苏会敏
导　师: 李祥瑞
学　校: 南京农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 捻转血矛线虫磷酸丙糖异构酶谷氨酸脱氢酶基因克隆酶活性分析
分类号: S852.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)属毛圆科(Trichostrongylidae)血矛属(Haemonchus)线虫,寄生于反刍动物(绵羊、山羊和牛等)第四胃,常因吸血导致宿主贫血和衰弱,引起幼龄动物尤其是羔羊的死亡,对畜牧业造成了极大的经济损失。该病传统的防治主要采用化学驱虫药和饲养管理相结合,但随着近年来抗药虫株的出现和蔓延,传统的化学防治法已受到了严峻的挑战。研制安全、有效的疫苗是防治该病亟待解决的问题。磷酸丙糖异构酶(Triosephosphate isomerase, TPI)是一种糖酵解酶,在机体内参与葡萄糖分解代谢,催化丙糖磷酸异构体在二羟丙酮磷酸和D型甘油醛-3-磷酸之间的可逆转换,在糖酵解、糖原异生、脂肪酸生物合成以及磷酸戊糖代谢中都发挥着重要的作用。本文首次克隆了HcTPI的全长基因并进行了原核表达,并对重组HcTPI蛋白的酶动力学特性进行了研究。1.捻转血矛线虫磷酸丙糖异构酶cDNA基因的克隆和序列分析根据GenBank中公布的捻转血矛线虫磷酸丙糖异构酶序列表达标签EST(登录号为CB015183)设计基因特异性引物,利用5’-RACE和3’-RACE技术分别获得该基因的5’端和3’端未知序列,将这些序列拼接后获得捻转血矛线虫TPI基因的全长cDNA序列(986bp),序列分析发现,该基因含有一个744bp的最大开放阅读框(ORF)、64 bp 5’非翻译区,178bp 3’非翻译区。根据此ORF设计1对特异性引物,以捻转血矛线虫的总RNA为模板,采用RT-PCR技术,扩增出744bp的产物,与推导出的ORF长度一样,二者序列同源性为99%。利用DNAstar等软件,结合网络资源对其进行分析,发现该基因编码247个氨基酸,推测蛋白的等电点为8.18,分子质量为27.47kDa,且含有磷酸丙糖异构酶的活性功能位点序列AYEPVWAIGTG,与许多物种的磷酸丙糖异构酶都一定的同源性。2.捻转血矛线虫磷酸丙糖异构酶基因的原核表达及重组酶活性测定应用DNA重组技术,将TPI的ORF克隆到原核表达载体pET32a(+)中,经酶切鉴定正确后转化大肠杆菌Rosetta(DE3),以IPTG诱导表达重组HcTPI蛋白。SDS-PAGE电泳结果显示,pET32a(+)-HcTPI在大肠杆菌中得到成功表达,重组蛋白分子量在45kDa左右。菌体经超声破碎后的沉淀与上清的SDS-PAGE分析结果表明,融合蛋白在上清和包涵体中均有表达。以感染捻转血矛线虫山羊的血清作为第一抗体,兔抗山羊IgG-HRP为第二抗体进行western blot分析,结果显示在45kDa处出现特异性条带。采用与αα-磷酸甘油脱氢酶偶联法对该重组蛋白进行酶活性测定,结果表明其最适反应温度为40℃,pH值为7.5。酶促反应动力学结果显示,Km和Vmax分别为0.96mmo1/L和0.341 mmol/(L·min)。3.捻转血矛线虫谷氨酸脱氢酶的原核表达及重组酶的活性测定将表达捻转血矛线虫谷氨酸脱氢酶(HcGDH)的原核表达质粒pET-28a(+)-HcGDH转入大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导其表达。SDS-PAGE电泳结果显示,pET-28a(+)-HcGDH在大肠杆菌中得到成功表达,融合蛋白分子量在63kDa左右。菌体经超声破碎,对沉淀与上清进行SDS-PAGE分析,结果表明重组蛋白以包涵体的形式存在。用His蛋白纯化柱对该包涵体蛋白变性纯化后,用梯度尿素对其进行连续透析复性。对纯化复性的蛋白进行谷氨酸脱氢酶活性测定,结果发现该酶为NAD特异性酶且最适反应温度和pH分别为40℃，8.0。酶促反应动力学结果显示,Km和Vmax分别为1.26mmo1/L和0.055 mmol/(L·min)。

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摘要 6-8ABSTRACT 8-10前言 10-11第一篇文献综述 11-29 第一章捻转血矛线虫病概述及其诊断与防治 11-17 1.1 病原学 11-12 1.2 致病作用 12-13 1.3 症状及病理变化 13 1.4 诊断与防治 13-15 参考文献 15-17 第二章磷酸丙糖异构酶的研究进展 17-23 2.1 磷酸丙糖异构酶的来源及功能 17-18 2.2 磷酸丙糖异构酶的结构及催化机理 18-19 2.3 磷酸丙糖异构酶酶学研究 19-20 2.4 捻转血矛线虫磷酸丙糖异构酶研究进展 20-21 参考文献 21-23 第三章谷氨酸脱氢酶的研究进展 23-29 3.1 谷氨酸脱氢酶的催化活性 23-24 3.2 谷氨酸脱氢酶结构和功能之间的关系 24-26 3.3 捻转血矛线虫谷氨酸脱氢酶的研究进展 26-27 参考文献 27-29第二篇试验研究 29-79 第四章捻转血矛线虫磷酸丙糖异构酶cDNA基因的克隆和序列分析 29-55 4.1 材料与方法 30-43 4.1.1 材料 30-31 4.1.2 方法 31-43 4.2 结果 43-50 4.2.1 TPI基因5’端片段的扩增 43-44 4.2.2 TPI基因3’端片段的扩增 44-45 4.2.3 HcTPI基因全长cDNA序列的获得及生物信息学分析 45-46 4.2.4 HcTPI基因的RT-PCR扩增及阳性克隆鉴定 46-47 4.2.5 HcTPI基因的测序及分析 47-50 4.3 讨论 50-52 参考文献 52-55 第五章捻转血矛线虫磷酸丙糖异构酶基因的原核表达与酶活性测定 55-71 5.1 材料与方法 55-62 5.1.1 材料 55-58 5.1.2 方法 58-62 5.2 结果 62-66 5.2.1 pET32a(+)-HcTPI重组表达质粒的构建 62 5.2.2 重组蛋白诱导表达的SDS-PAGE分析 62-63 5.2.3 重组蛋白在E.coli中的分布 63-64 5.2.4 目的蛋白的纯化 64-65 5.2.5 重组蛋白的Western blot分析 65 5.2.6 重组蛋白酶活性的测定 65-66 5.3 讨论 66-68 参考文献 68-71 第六章捻转血矛线虫重组谷氨酸脱氢酶的诱导表达及酶活活性测定 71-79 6.1 材料与方法 72 6.1.1 材料 72 6.1.2 方法 72 6.2 结果 72-75 6.2.1 重组蛋白诱导表达的SDS-PAGE分析 72-73 6.2.2 pET28a(+)-GDH重组蛋白在E.coli中的分布 73-74 6.2.3 重组蛋白的纯化与复性 74 6.2.4 重组蛋白酶活性的测定 74-75 6.3 讨论 75-77 参考文献 77-79全文总结 79-81致谢 81

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