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江苏地区白斑综合征分子流行病学调查

作　者: 高慧敏
导　师: 费荣梅
学　校: 南京农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 白斑综合征病毒 流行病学调查 致病相关蛋白基因 易变区 序列分析
分类号: S945.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


白斑综合征上世纪90年代初最先爆发于我国台湾地区,此后迅速传播至整个亚洲及欧美的主要对虾养殖地区,给对虾养殖业造成了极大损失。具有暴发流行趋势,表现为病程短、死亡率高。发病后3-10 d大部分对虾死亡,部分虾池的死亡率可达到100%。而且随着病原的变异,养殖容量增大以及养殖环境不断恶化,对其防控的难度也逐渐增大。白斑综合征病毒是引起养殖对虾暴发性流行病的主要病原。一种大型的双链DNA病毒,隶属于线头病毒科(Nimaviridae),是该科唯一成员。到目前为止共有3个WSSV基因组全序列在GenBank上公布,分别为泰国株,中国台湾株,和中国大陆株。泰国株基因序列全长292 967bp,中国大陆株基因序列全长305 107 bp,中国台湾株基因序列全长307 287 bp。从2009年冬至2010年秋,对江苏连云港、盐城、南京以及浙江的台州和福建的厦门等地一共采集了548尾虾,包括中国对虾,凡纳滨对虾,日本对虾,脊尾白虾,斑节对虾,罗氏沼虾,红虾等。对这些虾进行白斑综合征病毒套式PCR检测,结果,从548只虾样中,检测出白斑综合征病毒98株,白斑综合征病毒阳性检出率为17.88%。调查表明,江苏地区白斑综合征病毒发病率较高。选取几株从各地采集的虾中分离出的白斑综合征病毒阳性株,选取编码囊膜蛋白的基因VP19, VP24, VP28基因和一个编码核衣壳蛋白的基因VP35基因,根据GenBank上公布的中国大陆株全基因序列分别进行设计引物,之后再进行克隆测序,利用软件分析江苏等地这些各分离株在这些致病相关蛋白基因中的差异。比较对虾白斑综合征病毒(WSSV)的泰国株(TH株)、中国株(CN株)、中国台湾株(TW株)易变区的差异,根据GenBank中这些毒株的两端外延保守序列设计一对特异性引物,分别用PCR方法扩增并克隆江苏等地分离株的易变区基因,采用MEGA4.0和CloneManager软件对序列进行比对、同源性计算和基因进化树的绘制,分析了不同毒株间易变区的特点,结果表明易变区的变化在某种程度上可显示WSSV的演化。

全文目录


目录  4-8摘要  8-9ABSTRACT  9-11第一篇 文献综述  11-31  第一章 白斑综合征研究进展  11-26    1 对虾白斑综合征简介  11-13      1.1 临床症状病理变化  11      1.2 易感动物  11-12      1.3 传播途径及传播机制  12      1.4 WSSV的致病机理  12-13    2 白斑综合征病毒  13-26      2.1 分类与命名  13      2.2 病毒分子形态结构及理化特性  13      2.3 主要检测技术  13-16        2.3.1 电镜观察  13-14        2.3.2 PCR检测技术  14        2.3.3 环介导等温扩增技术  14        2.3.4 免疫血清学检测技术  14-15        2.3.5 核酸探针检测  15        2.3.6 生化检测  15        2.3.7 DNA微阵列  15-16      2.4 基因组特征  16      2.5 致病相关蛋白基因  16-20        2.5.1 囊膜蛋白基因  16-17        2.5.2 核衣壳蛋白基因  17-18        2.5.3 病毒复制关键酶基因  18-19        2.5.4 其它基因  19-20      2.6 基因组易变区  20-23        2.6.1 ORF23/24  20-21        2.6.2 ORF14/15  21        2.6.3 可能的转座酶基因(transposase)  21        2.6.4 同源重复区(homologous regions, hrs)  21-22        2.6.5 VNTR  22-23        2.6.6 单核苷酸突变  23      2.7 WSSV的复制  23-24      2.8 WSSV分子致病机制  24-26        2.8.1 WSSV囊膜蛋白及其受体的相互作用  24        2.8.2 非结构蛋白在WSSV侵染中的作用  24-25        2.8.3 WSSV的转录翻译机制  25        2.8.4 WSSV的潜伏机制  25-26  参考文献  26-31第二篇 试验部分  31-75  第二章 江苏地区白斑综合征流行病学调查  31-43    1 材料与方法  31-34      1.1 虾样采集及编号  31      1.2 白斑综合征病毒阳性虾样  31      1.3 主要试剂和酶  31-32      1.4 主要仪器设备  32      1.5 虾样的处理  32      1.6 对虾白斑综合征病毒DNA的提取  32      1.7 引物的设计  32      1.8 对虾白斑综合征病毒的PCR扩增  32-33      1.9 PCR产物的鉴定,回收和纯化  33      1.10 PCR产物的T/A连接  33-34      1.11 连接产物的转化  34        1.11.1 感受态细胞的制备  34        1.11.2 连接产物的转化(热激法)  34      1.12 阳性克隆的PCR鉴定  34      1.13 对虾白斑综合征病毒检测基因的序列测定  34    2 结果  34-39      2.1 阳性样PCR检测结果  34-35      2.2 虾样采集情况及检测结果统计  35-39    3 讨论  39-40    参考文献  40-43  第三章 江苏地区白斑综合征病毒致病相关蛋白基因序列差异比较  43-67    1 材料与方法  44-47      1.1 实验材料与试剂  44      1.2 对虾白斑病毒综合征病毒分离株  44      1.3 白斑综合征病毒致病相关蛋白基因选取  44      1.4 对虾白斑综合征病毒DNA的提取  44      1.5 引物设计  44      1.6 PCR扩增体系及条件  44-45      1.7 PCR产物的鉴定,回收和纯化  45      1.8 PCR产物的T/A连接  45      1.9 连接产物的转化  45-46      1.10 阳性克隆的PCR鉴定  46      1.11 虾白斑综合征病毒致病相关蛋白基因的序列测定  46      1.12 测序结果分析  46-47    2 结果  47-63      2.1 vp19  47-51      2.2 VP24  51-57      2.3 VP28  57-63      2.4 VP35  63    3 讨论  63-65    参考文献  65-67  第四章 白斑综合征病毒易变区的序列比较  67-75    1 材料  67-68      1.1 毒株来源  67      1.2 主要试剂  67      1.3 主要仪器设备  67-68    2 方法  68-69      2.1 对虾白斑综合征病毒DNA的提取  68      2.2 引物的设计  68      2.3 分离株的PCR扩增体系和条件  68      2.4 PCR产物的鉴定、回收、纯化  68      2.5 PCR产物的T/A连接  68-69      2.6 连接产物的转化  69      2.7 阳性克隆的PCR鉴定  69      2.8 对虾白斑综合征病毒易变区基因的序列测定  69      2.9 测序结果分析  69    3 结果  69-71      3.1 各分离株易变区PCR结果  69-70      3.2 易变区核苷酸序列比较分析  70-71      3.3 进化关系分析结果  71    4 讨论  71-73    参考文献  73-75全文总结  75-77致谢  77

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产保护学 > 甲壳类病虫害及其防治 > 虾类
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