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失水胁迫下切花月季丝氨酸蛋白酶RhSep1基因相关研究

作　者: 刘晓娇
导　师: 田自华; 谢利娟
学　校: 内蒙古农业大学
专　业: 植物学
关键词: 切花月季丝氨酸蛋白酶失水胁迫生物信息学分析基因重组蛋白表达荧光定量PCR
分类号: S685.12
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

月季切花(Rosa Hybrida)在花卉市场具有较大的前景和需求量,但是由于月季切花的采摘、加工、运输等环节都会对切花造成失水胁迫,失水胁迫加速了月季切花的衰老过程,进一步影响了切花的寿命和质量,因此提高月季切花对失水胁迫的耐性具有实用性价值。根据对月季切花在失水胁迫过程中花瓣内肽酶的研究,其结果表明失水胁迫显著诱导了丝氨酸蛋白酶的活性。本文在已获得切花月季丝氨酸蛋白酶RhSep1基因序列的基础上,对RhSep1丝氨酸蛋白酶在切花月季失水胁迫过程中的作用进行探索。为了更好的开展后续研究,首先对切花月季丝氨酸蛋白酶RhSep1进行生物信息学分析,全面了解RhSep1的分子量、跨膜结构、疏水、信号肽、同源性,功能位点等可能的理化结构,为研究丝氨酸蛋白酶RhSep1在失水胁迫中的作用起到铺垫。将已获得的RhSep1基因重组到PET28a (+)载体中,构建重组表达载体,并转染到大肠杆菌中进行诱导表达。SDS-PAGE和Western Blot结果表明丝氨酸蛋白酶降解严重,表达条件优化和更换菌种,均不能使目的蛋白明显表达。RhSep1基因相对荧光定量PCR表明RhSep1基因随着月季失水胁迫强度增加,表达也随之上升,但是该蛋白酶并不是失水胁迫诱导所产生。本实验所研究的内容提示了从切花月季花瓣中克隆出的RhSep1蛋白酶参于月季的失水胁迫生理,同时该酶的生化性质及在失水胁迫过程的作用有待进一步研究。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-7
1 引言  7-18
  1.1 植物失水胁迫信号转导的分子基础  7-11
    1.1.1 ABA受体：PYR/PYL/RCAR  7-8
    1.1.2 ABA信号转导的负调控元件：PP2Cs蛋白  8
    1.1.3 ABA信号转导的正调控元件：SnRK2s  8-9
    1.1.4 各元件相互作用的结构基础  9-10
    1.1.5 ABA信号转导的模式  10-11
  1.2 提高植物失水胁迫抗性的研究进展  11-14
    1.2.1 失水胁迫下外源物质对植物的影响  11-12
    1.2.2 外源物质GSH对植物失水胁迫的影响  12
    1.2.3 外源物质SA对植物失水胁迫的影响  12-13
    1.2.4 外源物质甜菜碱对植物失水胁迫的影响  13
    1.2.5 外源物质ABA对植物失水胁迫的影响  13-14
  1.3 抗氧化酶有助于提高植物抗失水胁迫  14
  1.4 内肽酶参与的植物逆境生理  14-15
  1.5 丝氨酸蛋白酶与植物失水胁迫  15-16
    1.5.1 丝氨酸蛋白酶在内肽酶中的突出表现  15-16
    1.5.2 丝氨酸蛋白酶的作用  16
  1.6 本课题研究的目的及意义  16-18
2 材料与方法  18-29
  2.1 材料  18-21
    2.1.1 菌株与质粒  18
    2.1.2 培养基及试剂  18-21
    2.1.3 主要仪器设备  21
  2.2 方法  21-29
    2.2.1 丝氨酸蛋白酶RhSep1基因生物信息学分析  21-22
    2.2.2 丝氨酸蛋白酶RhSep1基因表达载体构建  22-24
    2.2.3 重组质粒PET28a(+)-RhSep1转染  24-25
    2.2.4 重组菌PET28a(+)-RhSep1-BL21(DE3)表达  25-26
    2.2.5 丝氨酸蛋白酶RhSep1原核表达条件优化  26
    2.2.6 实时定量PCR检测RhSep1表达水平  26-29
3 结果分析  29-43
  3.1 丝氨酸蛋白酶RhSep1生物信息学分析结果  29-34
    3.1.1 RhSep1序列信号肽分析  29
    3.1.2 RhSep1疏水性分析  29-30
    3.1.3 RhSep1蛋白质序列跨膜区分析  30-31
    3.1.4 RhSep1蛋白同源性分析  31-32
    3.1.5 RhSep1功能位点分析  32-33
    3.1.6 RhSep1三级结构预测  33-34
  3.2 丝氨酸蛋白酶RhSep1基因表达载体构建结果  34-35
    3.2.1 RhSep1 DNA的制备结果  34
    3.2.2 载体DNA的制备结果  34-35
    3.2.3 pET-28a(+)-RhSep1测序结果  35
  3.3 重组菌 PET28a(+)-RhSepI- BL21 (DE3)表达结果  35-36
  3.4 重组菌pET-28a(+)-RhSep1-BL21(DE3)western blot结果  36
  3.5 重组菌pET-28a(+)-RhSep1-BL21(DE3)诱导条件优化结果  36-37
  3.6 实时定量PCR检测RhSep1表达水平分析  37-43
    3.6.1 切花月季花瓣总RNA提取结果分析  37-38
    3.6.2 管家基因ACTB检测结果  38-39
    3.6.3 目的基因RhSep1检测结果  39-41
    3.6.4 标准品和样品扩增曲线和融解曲线分析  41-42
    3.6.5 目的基因的相对表达量(以CK-0h作为对照样品)  42-43
4 讨论  43-48
  4.1 植物失水胁迫初期信号转导基础  43-44
  4.2 丝氨酸蛋白酶RhSep1基因分析  44-45
  4.3 RhSep1蛋白酶的异源表达  45-47
  4.4 Real Time PCR确定目的基因RhSep1在失水胁迫下的相对表达量  47-48
5 结论  48-50
致谢  50-51
参考文献  51-61
作者简介  61

失水胁迫下切花月季丝氨酸蛋白酶RhSep1基因相关研究

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