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龙眼叶片黄酮类物质生物合成关键基因的克隆与表达研究

作　者: 郑洁红
导　师: 邱栋梁; 潘东明
学　校: 福建农林大学
专　业: 果树学
关键词: 龙眼芦丁槲皮素基因表达启动子
分类号: S667.2
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

龙眼（Dimocarpus longan Lour.）原产于我国的亚热带水果，是福建省重要的特色果树。具文献记载，龙眼含有丰富的黄酮类物质，具有很高的药用价值。前人对龙眼黄酮类物质的研究主要集中在果实中这类物质的成分与含量的研究，但对其合成机理不甚了解。因此，本研究通过比较不同品种间芦丁和槲皮素的含量差异，克隆芦丁和槲皮素合成过程中相关基因的cDNA序列和启动子序列，研究这些基因在不同品种中的表达与调控，从而明确了黄酮类物质合成途径的关键基因，为进一步揭示黄酮类物质合成途径的分子机制奠定了良好基础。取得的主要研究结果如下：1、利用HPLC技术对龙眼4个品种‘松风本’、‘石硖’、‘立冬本’和‘乌龙岭’叶片的芦丁和槲皮素含量进行测定。分析结果表明，4个品种间芦丁的相对含量具有显著差异，含量最高的是‘乌龙岭’，达到439.8μg/g，含量最低的是‘石硖’，低于260μg/g；4个品种的黄酮含量有差异显著。在对4个龙眼品种中的槲皮素测定结果表明，四个品种中，松风本含量最低，为69.6μg/g，而石硖和立冬本的相对含量差异不显著，分别为131.8μg/g和129.1μg/g，但在乌龙岭叶片中没有检测到槲皮素。2、本研究利用RACE技术，以龙眼叶片cDNA为模板克隆得到Dlpal和Dlf3h的cDNA全长序列，得到FLS的保守区序列Dlfls，生物信息学分析结果表明这些序列分别与已克隆的PAL、F3H和FLS cDNA序列具有较高的同源性，通过对Dlpal和Dlf3h的编码产物进行预测，结果也表明两者的编码产物分布具有PAL和F3H的保守结构域，初步能断定Dlpal、Dlf3h和Dlfls是龙眼叶片的结构基因，参与了黄酮类物质的合成过程。根据Dlpal cDNA序列预测龙眼Dlpal酶蛋白的分子量约为306.4KD，是个碱性的亲水蛋白，属于芳香族氨基酸解氨酶，含有PAL（PLN02457）和PAL-HAL保守结构域，与PAL和HAL具有相同的功能。通过亚细胞定位分析，推测Dlpal为N端朝内由外到内的跨膜结构，在内质网上合成，并催化苯丙素类化合物合成。根据Dlf3h cDNA序列预测Dlf3h酶蛋白分子量约为45.3KD，是个亲水性蛋白，定位于内质网膜，具有双向跨膜结构。Dlf3h的整条肽链横跨于内质网膜内外，催化5,7,4’-黄烷酮，生成2R,3R-黄烷酮醇。3、本研究采用Takara公司的TAIL-PCR试剂盒和I-PCR技术克隆了龙眼叶片中CHI、CHS、PAL、F3H基因的5’端上游序列，PlantCare分析表明所获得的CHI-P、CHS-P、PAL-P、F3H-P均含有CHS、CHI、PAL、F3H基因启动子序列。本研究所获得的5个基因的启动子序列中，都包含光反应元件，如SP1、Box4、L-box等，说明参与黄酮类物质合成的基因启动子中潜在着复杂的光应激表达模式，PAL、CHI、CHS、F3H的表达具有光依赖性。除共同含有光反应元件外，还有一些与植物激素有关的元件。根据F3H、CHS和CHI的启动子序列中都包含的脱落酸响应的顺式作用元件推断F3H、CHS和CHI在龙眼叶片的类黄酮合成过程中协同表达，受到内源激素的调节。CHI-P含有赤霉素响应的元件TCCACCT-motif，CHS-P和PAL-P含有参与茉莉酸甲酯响应的元件CGTCA-motif，CHS-P中还含有水杨酸响应的元件TCA-element。4、龙眼叶片的Dlpal、CHI、CHS、Dlf3h、Dlfls在4个品种中表现出不同的表达模式，同一个基因在不同品种中的表达量具有显著性差异，结合第二章的结果，表明在同一个品种中，这些基因的表达量与黄酮类物质芦丁和槲皮素的含量具有正相关性。因此，可以认为Dlpal、CHI、CHS、Dlf3h、Dlfls在芦丁和槲皮素的合成过程中都起到了关键作用，这些基因的转录水平决定了龙眼叶片中黄酮类物质的含量。

全文目录

缩略词  7-8
摘要  8-10
Abstract  10-12
第一章前言  12-19
  1 黄酮类化合物的种类与作用  12-13
  2 黄酮类化合物的生物合成  13-16
    2.1 查尔酮合成酶  14-15
    2.2 查尔酮异构酶  15
    2.3 黄烷酮 3-羟化酶  15-16
    2.4 黄酮醇合成酶  16
    2.5 苯丙氨酸解氨酶  16
  3. 克隆植物（类黄酮合成酶）基因启动子的方法与应用研究进展  16-18
    3.1 利用 PCR 法克隆植物基因启动子  16-17
    3.2 植物基因启动子的应用  17-18
  4 本论文研究的目的意义和主要内容  18-19
第二章不同龙眼品种中黄酮含量的测定  19-23
  1 材料与方法  19-20
    1.1 试验材料  19
    1.2 试验试剂和仪器  19
    1.3 试验方法  19-20
  2 结果与分析  20-21
    2.1 四个龙眼品种叶片芦丁含量的 HPLC 分析  20
    2.2 四个龙眼品种叶片槲皮素含量的 HPLC 分析  20-21
  3 讨论  21-22
  4 小结  22-23
第三章龙眼叶片中类黄酮物质合成关键基因 cDNA 的克隆  23-69
  1 材料  23-24
    1.1 试验材料  23
    1.2 仪器设备与试剂  23-24
  2 方法  24-37
    2.1 龙眼叶片总 RNA 提取和检测  24-25
    2.2 龙眼叶片 Dlpal 基因 cDNA 全长的克隆  25-32
    2.3 龙眼叶片 Dlf3h 基因 cDNA 全长的克隆  32-36
    2.4 龙眼叶片 Dlfls 基因保守区序列的克隆  36-37
  3 结果与分析  37-64
    3.1 龙眼叶片总 RNA 的提取与纯度检测  37-38
    3.2 龙眼叶片 Dlpal 基因 cDNA 全长的克隆及生物信息分析  38-50
    3.3 龙眼叶片 Dlf3h 基因 cDNA 全长的克隆及生物信息分析  50-63
    3.4 龙眼叶片 Dlfls 基因 cDNA 保守区的克隆及生物信息分析  63-64
  4 讨论  64-67
    4.1 龙眼类黄酮物质合成途径中相关酶基因序列的克隆  64-65
    4.2 龙眼叶片 Dlpal 及其编码产物在类黄酮物质合成过程中的作用  65-66
    4.3 龙眼叶片 Dlf3h 及其编码产物在类黄酮物质合成过程中的作用  66-67
  5 小结  67-69
第四章龙眼叶片黄酮类物质合成关键酶基因启动子的克隆  69-86
  1 材料  69
    1.1 试验材料  69
    1.2 仪器设备与试剂  69
  2 方法  69-75
    2.1 龙眼叶片 DNA 的提取  69-70
    2.2 引物设计  70-71
    2.3 染色体步移法克隆启动子序列  71-74
    2.4 反向 PCR 克隆启动子序列  74-75
  3 结果与分析  75-82
    3.1 龙眼叶片 DNA 的提取  75
    3.2 用染色体步移法扩增已知 cDNA 序列的启动子序列  75-81
    3.3 CHI、CHS、F3H 和 PAL 基因 5′端调控序列的顺式作用元件分析  81-82
  4 讨论  82-84
    4.1 不同方法对启动子克隆的效果  82-83
    4.2 CHS、CHI、PAL、F3H 基因 5’端调控序列启动子序列的确定  83
    4.3 顺式调控元件与黄酮类物质合成相关基因的表达调控  83-84
  5 小结  84-86
第五章龙眼叶片中黄酮类物质合成关键酶基因的表达研究  86-93
  1 材料与方法  86-88
    1.1 试验材料  86
    1.2 方法  86-88
  2 结果与分析  88-91
    2.1 Dlpal 基因在不同龙眼品种中的表达分析  88-89
    2.2 CHS 基因在不同龙眼品种中的表达分析  89
    2.3 CHI 基因在不同龙眼品种中的表达分析  89-90
    2.4 Dlf3h 基因在不同龙眼品种中的表达分析  90
    2.5 Dlfls 基因在不同龙眼品种中的表达分析  90-91
  3 讨论  91-92
  4 小结  92-93
第六章结论与研究展望  93-95
  1 结论  93-94
  2 研究展望  94-95
致谢  95-96
参考文献  96-115
附录  115-120
  附录 I 龙眼叶片芦丁 HPLC 分析相关图谱  115-118
  附录 II 槲皮素流动相及标样和样品图谱  118-120

龙眼叶片黄酮类物质生物合成关键基因的克隆与表达研究

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