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胡萝卜抗冻蛋白AFP基因的克隆及对葡萄的遗传转化

作　者: 褚明宇
导　师: 陈佰鸿
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 果树学
关键词: 胡萝卜AFP 葡萄 再生 转化
分类号: S663.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


我国葡萄（Vitis vinifera）主栽品种抗冻性弱，根系的抗寒能力差，冬季需要埋土越冬；因此通过遗传转化将植物抗冻基因导入葡萄中，培育转基因葡萄新品系，对改良葡萄抗寒能力具有重要意义。本研究通过PCR方法成功克隆了胡萝卜抗冻蛋白AFP基因并对其进行序列分析，构建了胡萝卜AFP基因的植物表达载体pBI-AFP，以宝石无核（Ruby Seedless)为受体材料进行了遗传转化。主要结果如下：1以胡萝卜植物组织基因组DNA为模板，通过PCR方法，获得了胡萝卜抗冻蛋白AFP基因，并连接到pGEM-T easy载体中。2通过ProtParam软件和蛋白分析软件Predictprotein对AFP抗冻基因生物信息学的分析，预测该蛋白的分子式为C1709H2680N448O502S16，相对分子质量为38.048kDa，等电点为5.43，该蛋白为亲水性分泌型蛋白，有信号肽存在；其蛋白质二级结构以α-螺旋、β-折叠和无规卷曲为主。3pGEM-AFP和pBI-121经Sac I和Xba I双酶切后连接，转化到大肠杆菌E.coilDH5α感受态细胞，成功构建了植物表达载体pBI-AFP。4通过液氮冻融法将植物表达载体pBI-AFP导入根癌农杆菌EHA105菌株中，经抗生素抗性筛选和PCR鉴定重组质粒成功导入农杆菌，构建了工程菌pBI-AFP/At.EHA105。5获得了适宜宝石无核葡萄叶片诱导不定芽的适宜培养基： CH+2-iP4mg/L+6-BA2mg/L+TDZ4mg/L，不定芽的诱导率为53.3%；获得了适宜超级无核葡萄叶片不定芽分化的培养基：CH+2-iP1mg/L+6-BA1mg/L+TDZ0.5mg/L+CPPU0.5mg/L+ZT1mg/L，不定芽诱导率为46.7%。6采用根癌农杆菌介导的叶盘转化法转化宝石无核葡萄，通过抗性筛选获得了转化葡萄植株，经PCR检测，初步证明目的基因AFP已导入葡萄植株中。

全文目录


摘要  2-3
Abstract  3-5
英文缩写符号及中英文对照表  5-6
目录  6-9
第一章 文献综述  9-22
  1 植物的冻害及冻害机理  9-11
    1.1 冻害  9-10
    1.2 冻害机理  10-11
  2 抗冻基因  11-14
    2.1 抗冻蛋白的来源及鱼类抗冻蛋白（AFP）  11-12
    2.2 鱼类 AFP 及在农业中的应用  12
    2.3 植物抗冻蛋白  12-13
      2.3.1 植物 AFPs 基因的发现  12-13
      2.3.2 植物 AFP 基因在提高植物抗冻性方面的应用  13
    2.4 抗冻相关基因  13-14
      2.4.1 抗冻转录因子 CBF 家族的发现  13-14
      2.4.2 CBFs 与抗冻基因  14
  3 葡萄遗传转化的研究  14-20
    3.1 葡萄再生体系的研究  14-17
      3.1.1 葡萄器官发生途径  15-16
      3.1.2 胚状体发生途径  16-17
    3.2 葡萄遗传转化途径的研究  17-20
      3.2.1 根癌农杆菌介导 Ti 质粒介导基因转化葡萄  17-18
      3.2.2 发根农杆菌转化葡萄  18-19
      3.2.3 基因枪法转化葡萄  19
      3.2.4 基因枪法和根癌农杆菌介导法相结合转化葡萄  19-20
  4 本项目的研究目的和意义  20-21
  5 技术路线  21-22
第二章 材料与方法  22-34
  1 材料  22-24
    1.1. 植物材料  22
    1.2 菌种与质粒  22
    1.3 酶与试剂  22
    1.4 PCR 引物的设计  22
    1.5 培养基  22-23
      1.5.1 细菌培养基  22-23
    1.6 缓冲液  23-24
  2 方法  24-28
    2.1 抗冻基因 AFP 的克隆  24-25
      2.1.1 胡萝卜基因组总 DNA 的提取方法（CTAB 法）  24-25
      2.1.2 抗冻蛋白 AFP 基因的扩增  25
    2.2 目的基因片段的回收  25
    2.3 目的片段与 pGEm-T easy Vector 载体的连接  25-26
    2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化  26-27
      2.4.1 大肠杆菌感受态细胞的制备  26
      2.4.2 大肠杆菌感受态细胞的转化  26-27
    2.5 质粒 DNA 的提取  27
    2.6 重组质粒的滞后鉴定  27
    2.7 重组质粒的 PCR 鉴定  27-28
    2.8 重组质粒的酶切鉴定体系  28
    2.9 重组质粒的序列测序  28
    2.10 AFP 基因序列的生物信息学分析  28
  3 抗冻基因 AFP 植物表达载体的构建  28-31
    3.1 质粒的酶切  28-29
    3.2 连接 AFP 和 pBI121 酶切产物  29
    3.3 转化大肠杆菌 DH5α感受态细胞  29-30
    3.4 农杆菌感受态细胞的制备  30
    3.5 中间载体直接导入农杆菌  30
    3.6 PCR 扩增  30-31
  4 葡萄遗传转化  31-34
    4.1 葡萄遗传转化再生体系的诱导  31-32
      4.1.1 不同生长调节剂种类及浓度对葡萄遗传转化再生体系的影响  31
      4.1.2 不同糖分处理的试管苗对葡萄遗传转化再生体系的影响  31
      4.1.3 不同基因型对葡萄遗传转化再生体系的影响  31-32
    4.2 不定芽增殖  32
    4.3 根癌农杆菌介导胡萝卜 AFP 转化葡萄  32-34
      4.3.1 卡那霉素筛选浓度确定  32
      4.3.2 农杆菌浓度和时间对葡萄遗传转化的影响  32
      4.3.3 羧苄青霉素敏感性试验  32
      4.3.4 农杆菌叶盘法转化  32-33
      4.3.5 转基因植株的 PCR 鉴定  33-34
第三章 结果与分析  34-46
  1 胡萝卜抗冻蛋白 AFP 基因克隆  34-39
    1.1 胡萝卜总 DNA 的提取与目的片段的 PCR 扩增及回收  34-36
      1.1.1 重组体的筛选  34
      1.1.2 重组质粒的滞后鉴定  34-35
      1.1.3 目的片段在重组质粒中的 PCR 鉴定  35
      1.1.4 目的片段的酶切鉴定  35-36
    1.2 AFP 基因测序结果及核苷酸序列分析  36-37
    1.3 AFP 基因氨基酸序列同源性分析及分子进化分析  37-38
    1.4 蛋白一级结构特征及理化性质分析  38-39
    1.5 蛋白质二级结构预测  39
  2. AFP 抗冻基因载体构建  39-41
    2.1 pGEM-AFP 和 pBI121 酶切  40
    2.2 植物表达载体的鉴定  40-41
    2.3 中间载体导入农杆菌的鉴定  41
      2.3.1 农杆菌的转化  41
      2.3.2 农杆菌转化的鉴定  41
  3 葡萄遗传转化  41-46
    3.1 不同激素组合对葡萄再生体系的影响  41-44
      3.1.1 不同糖分处理的葡萄试管苗对不定芽分化的影响  41-42
      3.1.2 不同激素组合对葡萄再生体系的影响  42-43
      3.1.3 不同基因型对葡萄再生体系的影响  43-44
    3.2 葡萄转化  44-46
      3.2.1 卡那霉素筛选浓度确定  44
      3.2.2 菌液浓度和时间的选择  44
      3.2.3 羧苄青霉素敏感性筛选  44-45
      3.2.4 转化再生植株的 PCR 鉴定  45-46
第四章 讨论  46-51
  1 胡萝卜 AFP 基因的进化关系  46-47
  2 中间表达载体构建策略  47
  3 影响葡萄遗传转化的因素  47-51
    3.1 外植体对再生体系的影响  47-48
    3.2 激素的种类和浓度  48-49
    3.3 影响葡萄转化的因素——菌液浓度和浸染时间  49
    3.4 抗性标记基因的影响  49-51
结论  51-52
参考文献  52-59
图版说明  59-60
致谢  60-61
个人简历  61-62
导师简介  62-63

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 果树园艺 > 浆果类 > 葡萄
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