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抗冻蛋白基因对山杨等植物遗传转化的研究

作　者: 李春霞
导　师: 祖元刚；柳参奎
学　校: 东北林业大学
专　业: 植物学
关键词: 胡萝卜AFP基因 RT-PCR 克隆载体构建山杨叶片再生遗传转化
分类号: S722
类　型: 硕士论文
年　份: 2003年
下　载: 162次
引　用: 4次
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内容摘要

克隆得到抗冻蛋白（antifreeze protein，AFP）基因，并通过农杆菌介导法将它导入杨树，培育抗寒冻的杨树新品种是本研究的主要目的。研究内容如下：首先利用RT—PCR方法从胡萝卜中克隆到抗冻蛋白基因，并构建了植物表达载体PBI—AFP，采用电转化法将PBI—AFP质粒转入根癌农杆菌EHA105中，构建了双元转化载体。经生根筛选及PCR检测，证明胡萝卜AFP基因已整合入烟草基因组。该工作证明了构建的载体是正确的并在植物中是有效表达的，这为培育高度抗寒耐寒作物、树木新品种提供基础，也为进一步研究抗冻蛋白基因的表达及其功能奠定了基础。本实验建立了山杨（Populus. davidiana Dode）叶片高效再生系统，选择激素浓度、基础培养基、琼脂浓度、蔗糖浓度等因素进行比较，实验表明：WP+6—BA1.0mg／L+NAA0.05mg／L+0.8％琼脂+2.0％蔗糖为最佳诱导山杨叶片不定芽分化的培养基，分化率达95％以上。通过卡那霉素敏感性实验，确定山杨叶片分化与根系对卡那霉素的忍耐极限分别为50mg／L，15mg／L。在建立山杨叶片高频再生系统的基础上，利用农杆菌介导叶盘法开展了AFP基因转化杨树的研究。确立了山杨叶片高效的遗传转化体系：将山杨叶片剪成1.0cm×0.5cm大小，预培养2—3d；菌液浓度为OD₆₀₀=0.4—0.5；侵染时间为8—10min；共培养3d。经过叶盘不定芽诱导的卡那霉素60mg／L、80mg／L 90天连续筛选，获得4株卡那霉素抗性植株，其中一株，经PCR检测为阳性，初步证明AFP基因已转入山杨中。

全文目录

1 前言  10-26
  1.1 植物冻害与抗冻机理  10-18
    1.1.1 细胞膜系与植物抗寒冻性  11-12
    1.1.2 酶系统多态性与植物抗寒冻性  12
    1.1.3 忍受胞外结冰与避免细胞内结冰  12-13
    1.1.4 抗冻基因的表达及其调节因子  13-15
    1.1.5 抗冻蛋白  15-18
      1.1.5.1 鱼类抗冻蛋白  15-16
      1.1.5.2 植物抗冻蛋白  16-18
      1.1.5.3 抗冻蛋白在植物抗冻生理中的作用  18
  1.2 植物基因工程研究的方法  18-22
    1.2.1 基因的克隆与分离  18-19
    1.2.2 基因的修饰  19-20
    1.2.3 植物转基因技术  20-22
    1.2.4 转基因植株的筛选与检测  22
  1.3 转基因杨树的研究概况  22-24
  1.4 本项目研究的立题依据及目的意义  24-26
2 胡萝卜抗冻蛋白基因的克隆及载体的构建  26-43
  2.1 材料  26-28
    2.1.1 植物材料  26
    2.1.2 试剂与仪器  26-28
  2.2 方法  28-37
    2.2.1 胡萝卜RNA的提取与检测  28-29
    2.2.2 目的基因的扩增  29-31
      2.2.2.1 引物设计与合成  29-30
      2.2.2.2 逆转录反应  30
      2.2.2.3 PCR扩增  30
      2.2.2.4 目的片段PCR产物的回收  30-31
    2.2.3 目的基因的克隆  31-33
      2.2.3.1 目的基因片段与克隆载体T载体的连接  31
      2.2.3.2 克隆载体向大肠杆菌的转化  31-32
      2.2.3.3 重组质粒的鉴定  32-33
    2.2.4 抗冻蛋白基因植物表达载体的构建  33-37
      2.2.4.1 PBI-AFP的PCR鉴定  34
      2.2.4.2 PBI-AFP的酶切检测  34
      2.2.4.3 根癌农杆菌EHA105电转化感受态细胞的制备  34-37
      2.2.4.4 利用电转化法将PBI-AFP导入农杆菌  37
      2.2.4.5 工程菌的鉴定  37
  2.3 结果与分析  37-41
    2.3.1 目的基因的扩增结果  37-38
    2.3.2 目的基因的克隆结果  38-40
      2.3.2.1 重组质粒的鉴定  38
      2.3.2.2 目的片段的DNA序列分析  38-40
    2.3.3 PBI-AFP植物表达载体的构建与鉴定  40-41
    2.3.4 PBI-AFP向农杆菌EHA105的导入及工程菌的鉴定  41
  2.4 讨论  41-43
    2.4.1 影响RT-PCR的因素  41-42
    2.4.2 PCR产物克隆策略  42
    2.4.3 农杆菌的直接转化法  42-43
    2.4.4 关于转化农杆菌的鉴定方法  43
  2.5 小结  43
3 农杆菌介导法转化烟草  43-47
  3.1 材料与方法  43-46
    3.1.1 试材  43-44
    3.1.2 方法  44-46
      3.1.2.1 培养基及激素的配制  44
      3.1.2.2 无菌苗的继代培养  44
      3.1.2.3 转化叶片处理及农杆菌侵染  44-45
      3.1.2.4 抗性芽的筛选及转基因植株在卡那霉素中的生根培养  45
      3.1.2.5 转基因植株的PCR检测  45-46
  3.2 结果与分析  46-47
    3.2.1 烟草转化芽的获得及卡那霉素抗性分析  46-47
    3.2.2 转AFP基因烟草的PCR检测  47
  3.3 小结  47
4 山杨叶片再生体系的建立及遗传转化研究  47-63
  4.1 试材  47-48
  4.2 方法  48-50
    4.2.1 山杨叶片再生体系的建立  48
    4.2.2 卡那霉素敏感性测定  48-49
    4.2.3 农杆菌介导的遗传转化  49-50
  4.3 结果与分析  50-60
    4.3.1 山杨叶片再生体系的建立  50-53
      4.3.1.1 最佳激素浓度、最适基础培养基的确立  50-52
      4.3.1.2 不同琼脂浓度对叶片分化的影响  52-53
      4.3.1.3 不同蔗糖浓度对叶片分化的影响  53
    4.3.2 卡那霉素敏感性测定结果  53-55
      4.3.2.1 叶片分化的卡那霉素敏感性试验  53-54
      4.3.2.2 生根的卡那霉素敏感性试验  54-55
    4.3.3 农杆菌介导的抗冻蛋白基因转化  55-60
      4.3.3.1 外植体状态对转化的影响  55
      4.3.3.2 预培养时间对转化效果的影响  55-56
      4.3.3.3 菌液浓度与转化率的关系  56-57
      4.3.3.4 侵染时间与转化率的关系  57
      4.3.3.5 共培养时间对转化率的影响  57-58
      4.3.3.6 抗性芽的筛选  58-59
      4.3.3.7 转基因山杨的PCR检测  59-60
  4.4 小结  60
  4.5 讨论  60-63
    4.5.1 山杨叶片再生系统的建立  60-61
    4.5.2 提高农杆菌介导法的遗传转化率  61-63
      4.5.2.1 外植体类型  61
      4.5.2.2 培养基PH值与培养温度  61-62
      4.5.2.3 预培养时间  62
      4.5.2.4 脱菌的重要性  62
      4.5.2.5 灵活使用卡那霉素  62-63
      4.5.2.6 提高转化率的其他途径  63
5 结论  63-64
6 下一步的研究设想  64-65
参考文献  65-72
附图  72-74
致谢  74

抗冻蛋白基因对山杨等植物遗传转化的研究

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