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小麦UDP-葡萄糖基转移酶基因Ta-UGT3的表达载体构建和转化小麦研究
作 者: 裴海岩
导 师: 王秀娥
学 校: 南京农业大学
专 业: 作物遗传育种
关键词: 小麦赤霉病 DON 二磷酸尿核甘葡萄糖基转移酶 Ta-UGT3 转化小麦
分类号: S512.1
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
下 载: 7次
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内容摘要
小麦赤霉病(Fusarium head blight, FHB)是一种由镰刀菌引起的世界性的真菌病害。FHB不仅降低作物产量,而且在侵染小麦穗组织的过程中产生的禾谷镰刀菌毒素严重影响籽粒品质,危害人畜健康。脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol, DON)是最主要的一类毒素。DON还抑制真核生物细胞的蛋白质合成,被认为是赤霉病的致病因子(Bai et al.,2001).培育抗病品种是目前控制小麦中DON含量的最有效方法。望水白表现高抗赤霉病,籽粒中DON积累量也明显低于其他小麦品种。本课题组应用芯片杂交结合cDNA文库筛选,在望水白中克隆了一个小麦二磷酸尿核甘葡萄糖基转移酶基因(Ta-UGT3). Ta-UGT3定位于与望水白抗赤霉病或抗DON的QTL相同的染色体3BS上,RT-PCR结果显示Ta-UGT3受DON诱导上调表达;对拟南芥转Ta-UGT3转基因植株DON抗性验证结果显示,该基因在拟南芥体内的过量表达在一定程度上可以增强拟南芥幼苗对DON的耐受力,推测Ta-UGT3与抗赤霉病或抗DON密切相关。为进一步研究该基因在小麦抗赤霉病中的功能,本研究构建了在35S强启动子控制下的Ta-UGT3基因的表达载体pBI-Ta-UGT3。对所构建的融合表达载体pBI-Ta-UGT3的进行PCR检测和BamH I、Kpn I双酶切,结果显示基因Ta-UGT3已经成功构建到融合表达载体中。利用基因枪法将pBI-Ta-UGT3和携带Bar基因的表达载体pAHC25共转化高感赤霉病的小麦品种Alondra’s,共获得108再生T0代植株。T0代转基因植株的GUS染色检测结果显示:在108个T0代单株中,有33株的后代根尖被染成蓝色。根据GUS染色结果,在T0代植株中选取12个株系种植于江浦赤霉病大棚中,利用35S启动子和Ta-UGT3基因拼接引物对T0植株进行PCR检测。结果发现,4株转入了Ta-UGT3基因。对这4个T0代株系的T1代植株进行PCR检测,结果显示,Ta-UGT3基因产生了分离,运用X2测验对阳性植株和阴性植株分离比例进行分析,发现只有T0-92衍生T1株系的阳性植株与阴性植株分离比例符合3:1,其余三个株系比例接近1:1,进一步证明了Ta-UGT3基因已整合进受体基因组。对4个T0代衍生株系的T1代转化植株利用单花滴注法进行赤霉病抗性鉴定,所得数据运用SAS软件中两样本均值的双尾t检验统计分析。结果显示:在鉴定的所有T1代阳性转基因植株中,接种B4-1或者F0609类型赤霉菌后,与受体对照相比,四个株系T1代阳性转基因植株平均病小穗率都有显著差异;与相对应阴性植株相比,四个株系的阳性植株平均病小穗率都没有显著差异。同时对T1代转化植株主要农艺性状的调查和分析结果表明,转基因阳性植株的株高、分蘖数等农艺性状与受体对照相比变化不显著;转基因阳性植株的穗长、小穗数等农艺性状与受体对照相比变化显著;阳性植株与其相对应的阴性植株在农艺性状方面没有显著性差异。
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全文目录
摘要 7-9ABSTRACT 9-11第一部分 文献综述 11-23 一 小麦抗赤霉病研究进展 11-18 1 小麦赤霉病 11-14 1.1 小麦赤霉病的发生及危害 11-12 1.2 禾谷镰刀菌及其毒素 12 1.3 脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON) 12-14 2 小麦抗赤霉病研究 14-18 2.1 小麦抗赤霉病类型及其遗传机制 14-15 2.2 小麦赤霉病抗性相关QTL的分子标记 15-17 2.3 小麦抗镰刀菌毒素积累的自然机制 17-18 二 尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶基因Ta-UGT3 18-20 1 尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶 18-20 2 Ta-UGT3基因的克隆 20 三 抗赤霉病相关基因的转化研究 20-21 四 本研究的目的及意义 21-23第二部分 研究报告 23-45 一 材料与方法 23-33 1. 试验材料 23-24 1.1 植物材料 23 1.2 菌株及表达载体 23-24 1.3 仪器设备 24 1.4 生化试剂 24 2 试验方法 24-33 2.1 受体材料准备 24-25 2.2 培养基成份 25 2.3 质粒载体的转化及构建 25-28 2.3.1 电击感受态细胞的制备 26-27 2.3.2 质粒DNA的电击转化 27 2.3.3 质粒DNA的提取 27 2.3.4 转化载体构建 27-28 2.4 微弹制备及基因枪轰击 28-29 2.4.1 质粒DNA的提取 28 2.4.2 微弹制备 28-29 2.4.3 轰击转化 29 2.5 抗性愈伤组织的筛选及植株再生 29 2.6 转基因植株根部GUS染色鉴定 29-30 2.6.1 试剂及其配制 29 2.6.2 染色 29-30 2.7 转基因植株的分子鉴定 30-32 2.7.1 微量法提取再生植株的基因组DNA 30-31 2.7.2 再生植株的PCR检测 31-32 2.8 转基因植株赤霉病抗性鉴定 32-33 2.9 主要农艺性状调查 33 二 结果与分析 33-43 1 表达载体的构建 33-34 2 Ta-UGT3基因的遗传转化 34 3 T_0代转基因植株的GUS染色检测 34-35 4 T_0代转基因植株的PCR检测 35-36 5 T_1代转基因植株的PCR检测 36-37 6 T_1代转基因植株的赤霉病抗性鉴定 37-40 7 转基因植株农艺相关性状分析 40-43 三 讨论 43-45全文结论 45-47参考文献 47-55致谢 55
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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 禾谷类作物 > 麦 > 小麦
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