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苹果高效遗传转化体系建立及转miR156和rSPL9基因的研究

作　者: 李文然
导　师: 代红艳
学　校: 沈阳农业大学
专　业: 果树学
关键词: 八棱海棠 子叶 离体再生 农杆菌 遗传转化
分类号: S661.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


随着栽培苹果基因组测序的完成,苹果基因的功能鉴定成为苹果分子生物学研究的重要内容,但是这依赖于高效的遗传转化体系。虽然根癌农杆菌介导的遗传转化在一些苹果基因型上获得成功,但是总体上转化效率偏低。本研究建立以子叶为外植体的八棱海棠的遗传转化体系,探索从八棱海棠和苹果品种嘎啦的实生后代中筛选并建立具有高再生能力且对农杆菌敏感的无性系,并将miR15(?)基因和(?)SPL9基因导入苹果。主要结果如下：1.以八棱海棠子叶为外植体,研究了外植体类型、外植体大小、暗培养时间、基本培养基、外植体与培养基的接触方式等对不定芽再生的影响。八棱海棠近轴端子叶的不定芽再生频率是远轴端子叶的2.3倍,平均再生芽数是远轴端子叶的3.2倍；以SC为基本培养基时,子叶再生芽频率达到90%,平均再生芽数达到9.14,而在附加相同激素的MS培养基上,再生频率和平均再生芽数分别为72.5%和6.28；八棱海棠1/3近轴端子叶平均再生芽数显著高于1/2近轴端子叶。2.在建立八棱海棠子叶高效再生体系的基础上,以1/3近轴端子叶为外植体,研究了菌液浓度、菌液浸染时间、共培养时间、推迟筛选时间对转化效率的影响,建立八棱海棠子叶为外植体的适宜的转化体系：菌液浓度OD600=0.5、叶片外植体在菌液浸泡8min、共培养3d、不进行推迟筛选培养。在此转化体系上抗性芽再生率达11.67%。3.以八棱海棠和嘎啦苹果的实生种子为试材,建立了2个苹果试管苗无性系群体,筛选出2个具有高再生能力的无性系：BT-9和GL-3。在附加BA的培养基上,BT-9叶片离体再生不定芽频率为100%,平均再生芽数达到18.4。GL-3叶片离体再生不定芽能力高于BT-9及嘎啦和寒富,在附加TDZ的培养基上,4个基因型的叶片再生率均为100%,但是GL-3的平均再生芽数为22.36,显著高于BT-9(15.5)、嘎啦(13.8)和寒富(10.16)4.利用GUS基因瞬时表达比较GL-3、BT-9、嘎啦、寒富对根癌农杆菌的敏感性,不同菌液浓度、不同浸染时间的GUS瞬时表达结果表明GL-3外植体上GUS瞬时表达率最高,说明GL-3对农杆菌的敏感性最强,适合进行遗传转化。5.分离出拟南芥的miR156基因和苹果的SPL9基因,并对SPL9基因上的miRl56结合位点进行突变,获得苹果rSPL9基因。以GL-3和寒富试管苗叶片为外植体,利用农杆菌介导法,将miRl56基因和苹果的SPL9基因导入GL-3和寒富苹果。CL-3非常适合用于遗传转化研究,转miR156基因的抗性芽再生率可达14.49%,而寒富转miR156基因抗性芽再生率可达7.06%。转miR156基因的苹果转化植株表现出根系分蘖能力增强的现象。转miR156基因的苹果转化植株表现出叶片再生不定芽能力增强的现象。

全文目录


摘要  10-12
ABSTRACT  12-14
第一章 文献综述  14-19
  1.1 苹果遗传转化研究进展  14-15
  1.2 影响植物遗传转化效率的因素  15-18
    1.2.1 影响遗传转化的内因  15-16
    1.2.2 影响遗传转化的外因  16-18
  1.3 本研究的目的意义  18-19
第二章 八棱海棠子叶离体再生及遗传转化体系的建立  19-33
  2.1 材料与方法  19-23
    2.1.1 植物材料  19
    2.1.2 离体再生试验设计  19
    2.1.3 遗传转化方法及试验设计  19-21
    2.1.4 培养基配制和培养条件  21
    2.1.5 GUS基因表达的组织化学染色分析方法  21
    2.1.6 nptⅡ基因的PCR检测  21-22
    2.1.7 数据调查与统计分析  22-23
  2.2 结果与分析  23-31
    2.2.1 八棱海棠成熟胚离体培养  23-24
    2.2.2 不同因素对八棱海棠子叶再生的影响  24-25
    2.2.3 不同因素对八棱海棠子叶遗传转化的影响  25-28
    2.2.4 转化植株的获得和鉴定  28-31
  2.3 讨论  31-32
    2.3.1 外植体类型对不定芽再生的影响  31
    2.3.2 以子叶作为遗传转化外植体的优点和缺陷  31-32
  2.4 小结  32-33
第三章 具有高再生能力且对农杆菌敏感的苹果无性系筛选  33-44
  3.1 材料与方法  33-34
    3.1.1 试管苗无性系建立  33
    3.1.2 无性系叶片离体再生能力比较试验  33
    3.1.3 苹果无性系对农杆菌敏感性试验  33-34
    3.1.4 数据调查与统计分析  34
  3.2 结果与分析  34-42
    3.2.1 八棱海棠无性系建立及具有高再生能力无性系的筛选  34-38
    3.2.2 嘎啦实生后代无性系的建立及及具有高再生能力无性系的筛选  38-40
    3.2.3 不同苹果基因型对农杆菌的敏感性  40-42
  3.3 讨论  42
    3.3.1 八棱海棠高离体再生能力的筛选  42
    3.3.2 GL-3具有高再生能力且对农杆菌敏感  42
  3.4 小结  42-44
第四章 miR156基因和rSPL9基因转化苹果的研究  44-64
  4.1 材料与方法  44-52
    4.1.1 苹果SPL9基因的定点突变  44-46
    4.1.2 拟南芥miR156基因的分离  46-48
    4.1.3 植物表达载体构建  48-50
    4.1.4 植物表达载体转化农杆菌  50-51
    4.1.5 农杆菌介导的叶盘法转化苹果  51-52
    4.1.6 数据调查与统计分析  52
  4.2 结果与分析  52-61
    4.2.1 过量表达载体的构建  52-56
    4.2.2 转化植株的获得  56-58
    4.2.3 miR156转化植株的PCR检测及卡那霉素抗性鉴定  58-60
    4.2.4 miR156转化植株的叶片再生能力和分蘖能力  60-61
  4.3 讨论  61-63
    4.3.1 miR156的作用  61-62
    4.3.2 过表达rSPL9对植物表型的影响  62-63
  4.4 小结  63-64
全文结论  64-65
参考文献  65-71
附录  71-74
致谢  74-75
攻读学位期间发表的论文  75

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 果树园艺 > 仁果类 > 苹果
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