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貉细小病毒分离鉴定及免疫原性研究

作　者: 康洪涛
导　师: 闫喜军
学　校: 中国农业科学院
专　业: 兽医
关键词: 貉细小病毒分离鉴定 VP2基因免疫原性荧光定量PCR
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

貉细小病毒性肠炎是一种急性、高度接触性传染病，近年来已成为严重危害养貉业的重要传染病之一。1984年貉细小病毒性肠炎在我国黑龙江省首次发生。1988夏咸柱等从不同地区肠炎病貉分离出3株细小病毒，从而首次证实了貉细小病毒在我国的存在。近年来，貉细小病毒性肠炎的流行有愈演愈烈的趋势，目前国内还没有专门针对貉细小病毒性肠炎的疫苗，大多采用水貂细小病毒肠炎灭活疫苗或是犬细小病毒弱毒疫苗进行免疫，虽然三种病毒在免疫学上具有交叉免疫保护，但免疫效果不够理想。因此针对貉细小病毒性肠炎安全高效疫苗的研制势在必行。为研制貉细小病毒性肠炎灭活疫苗，筛选出针对貉细小病毒性肠炎安全、高效的疫苗备选株。本研究应用CRFK细胞分别从辽宁和河北省发病貉的粪便中进行病毒分离，并通过形态学、血清学、分子生物学、动物回归及免疫接种等方法对分离株进行鉴定。成功分离出2株貉细小病毒，命名为LN10-1株和HeB10-1株。其中LN10-1株的VP2蛋白上决定宿主范围的93位氨基酸位点发生了突变（Asn→Lys）。VP2基因种系发生分析显示，LN10-1株位于猫泛白细胞综合征病毒（Feline panleukopenia virus，FPLV）、蓝狐细小病毒（Blue fox parvovirus，BFPV）、水貂肠炎病毒（Mink enteritis virus，MEV）组成的食肉类动物细小病毒聚类分支与由犬细小病毒（Canineparvovirus，CPV）组成的聚类分支之间。推测LN10-1株可能正处于FPLV与CPV进化的中间状态，或是CPV适应新宿主（貉）而形成的一种新病毒。分别由LN10-1株和HeB10-1株制备病毒含量为106.0TCID50灭活疫苗免疫结果显示，分离株免疫组接种21d其血凝抑制效价及中和抗体效价均达到攻毒保护水平（HI≥1:80；SN≥1:64），接种28d分离株免疫组细小病毒中和抗体效价可达到1:256以上。分离的两株貉细小病毒株可以作为针对貉细小病毒性肠炎灭活疫苗的候选株。为探索细小病毒基因组拷贝数与病毒含量之间相关性，本研究建立了利用荧光定量PCR技术定量检测貉细小病毒基因组拷贝数的方法。通过对RDPV LN10-1株VP2基因片段上的长度为92bp的保守片段进行PCR扩增，构建标准重组质粒，由已知浓度的重组质粒通过荧光定量PCR体系建立标准曲线，通过标准曲线得出RDPV LN10-1株样品的目标片段拷贝数。对拷贝数值与TCID50值进行相关性分析，分析结果显示基因组拷贝数值与病毒TCID50值存在极显著的正相关关系（P<0.01）。与血凝实验方法测定病毒滴度相比，其更能准确的代表活病毒的含量。本研究为探索利用定量荧光定量PCR方法进行细小病毒含量测定提供了实验依据，对动物生物疫苗的生产检验具有一定的实践意义。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-11
英文缩略表  11-12
第一章绪论  12-25
  1.1 肉食兽类细小病毒概述  12-14
    1.1.1 猫泛白细胞综合征病毒  12-13
    1.1.2 犬细小病毒  13
    1.1.3 水貂肠炎病毒  13
    1.1.4 貉细小病毒  13-14
  1.2 肉食兽细小病毒病原学特性  14-19
    1.2.1 肉食兽细小病毒的形态特点和理化性质  14
    1.2.2 肉食兽细小病毒基因结构  14-15
    1.2.3 肉食兽细小病毒结构蛋白与非结构蛋白的结构与功能  15-18
    1.2.4 肉食兽细小病毒的致病机理  18
    1.2.5 肉食兽细小病毒抗原性变异及进化与宿主范围关系  18-19
  1.3 实时荧光定量 PCR 技术进展  19-24
    1.3.1 实时荧光定量 PCR 技术原理  20
    1.3.2 实时荧光定量 PCR 技术中荧光标记方法的分类  20-23
    1.3.3 应用前景及在肉食兽细小病毒研究中的应用  23-24
  1.4 本研究的目的与意义  24-25
第二章貉细小病毒株的分离与鉴定  25-39
  2.1 材料  25-26
    2.1.1 病料  25
    2.1.2 细胞  25
    2.1.3 实验动物  25-26
    2.1.4 主要试剂  26
    2.1.5 主要仪器  26
  2.2 方法  26-30
    2.2.1 病毒分离  26
    2.2.2 形态学鉴定  26-27
    2.2.3 理化特性的鉴定  27
    2.2.4 PCR 鉴定  27-28
    2.2.5 血凝—血凝抑制(HA-HI)试验  28
    2.2.6 中和试验(SN)  28
    2.2.7 间接免疫荧光实验(IFA)  28-29
    2.2.8 VP2 基因克隆及序列测定  29
    2.2.9 动物回归试验  29-30
  2.3 结果  30-37
    2.3.1 病毒分离  30-31
    2.3.2 形态学鉴定  31
    2.3.3 理化性质鉴定  31-32
    2.3.4 PCR 鉴定结果  32
    2.3.5 血凝试验( HA)与血凝抑制(HI)  32-33
    2.3.6 分离毒株的中和试验  33
    2.3.7 间接免疫荧光试验  33-34
    2.3.8 VP2 基因序列测定与遗传进化分析  34-36
    2.3.9 动物回归试验结果  36-37
  2.4 讨论  37-39
第三章貉细小病毒的免疫原性研究  39-44
  3.1 材料  39-40
    3.1.1 毒株、细胞及猪红血球  39
    3.1.2 实验动物  39
    3.1.3 对照疫苗、病毒样颗粒及细小病毒试验阴、阳性血清  39-40
    3.1.4 主要仪器及试剂  40
  3.2 方法  40-41
    3.2.1 病毒的增值  40
    3.2.2 灭活疫苗的制备  40
    3.2.3 兔的疫苗效力试验  40-41
    3.2.4 貉的疫苗效力试验  41
  3.3 结果  41-42
    3.3.1 病毒 TCID50的测定  41
    3.3.2 兔的效力试验结果  41-42
    3.3.3 貉的效力试验结果  42
  3.4 讨论  42-44
    3.4.1 兔的免疫效力试验  42-43
    3.4.2 貉的免疫效力试验  43-44
第四章 TAQMAN-MGB 探针实时定量荧光 PCR 技术检测貉细小病毒含量的研究  44-52
  4.1 材料与方法  44-46
    4.1.1 仪器和试剂  44-45
    4.1.2 方法  45-46
  4.2 结果  46-50
    4.2.1 探针及引物的设计  46
    4.2.2 标准质粒的构建  46-47
    4.2.3 灵敏性检测  47-48
    4.2.4 标准曲线  48-49
    4.2.5 RDPV LN10-1 株样品拷贝数检测  49
    4.2.6 血凝性检测  49
    4.2.7 RDPV LN10-1 株样品病毒含量进行测定  49-50
    4.2.8 血凝价、基因组拷贝数对 TCID50值的统计学分析  50
  4.3 讨论  50-52
第五章结论  52-53
参考文献  53-58
附录  58-59
致谢  59-60
作者简历  60

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