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貉犬瘟热病毒和貉细小病毒分离鉴定及其双重PCR方法建立

作 者: 刘双翼
导 师: 侯喜林
学 校: 黑龙江八一农垦大学
专 业: 预防兽医学
关键词: 貉犬瘟热病毒 貉细小病毒 分离 鉴定 双重PCR
分类号: S852.65
类 型: 硕士论文
年 份: 2009年
下 载: 32次
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内容摘要


采集发病貉病理病料进行貉源犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)和貉细小病毒(raccoon dog Parvovirus,RDPV)的分离鉴定,并且建立检测貉源犬瘟热病毒和貉细小病毒的双重PCR诊断方法。按常规方法处理采集的病料,接种Vero和MDCK细胞进行病毒分离,对分离毒株进行血凝试验、中和试验、理化性质测定试验,应用RT–PCR和PCR方法检测感染细胞中的病毒核酸,并进行测序分析。根据CDV的N基因和CPV的VP2基因序列设计两对特异性引物对混合样品中貉源犬瘟热病毒和貉细小病毒进行双重PCR扩增,并优化反应条件,同时对其特异性和敏感性进行分析。应用建立的双重PCR方法对临床样本进行检测,并与商业试剂盒进行比较。分离到的病毒株分为不同的两类。一类接种vero细胞72h后产生明显的细胞病变(CPE);可以被犬瘟热阳性血清中和,中和效价为1:105;分离毒株对氯仿、乙醚敏感,对酸和热抵抗力弱,可以凝集鸡红细胞,其凝集作用可被犬瘟热阳性血清所抑制;RT-PCR技术检测病毒细胞培养液,扩增出的片段长为287bp,与预期设计的长度相同,经测序分析与MS01株(GenBank登录号为DQ887066)的同源性为99%。另一类接种MDCK细胞72h后产生明显的细胞病变(CPE),获得8个病毒分离株;病毒分离株可以被犬细小病毒阳性血清中和,中和效价为1:106~1:107;分离株对氯仿、乙醚不敏感,耐酸耐热,可以凝集猪红细胞,凝集效价为1:27~1:29,其凝集作用可被犬细小病毒阳性血清所抑制;PCR技术检测病毒细胞培养液扩增出的片段长为531bp,与预期设计的长度相同,经测序、序列比对分析,与犬细小病毒吉林分离株(GenBank登录号为EU310373)的同源性为99.6%,分离株属于CPV-2c型。用建立的双重PCR方法对混合样品中貉源犬瘟热病毒和貉细小病毒进行双重PCR扩增得到2条目的片段,其大小分别为287bp(犬瘟热病毒)、531bp(貉细小病毒),与试验设计相符,且与常规单一PCR结果一致;双重PCR的最低检出限量为:1个TCID50的貉犬瘟热病毒核酸、10个TCID50的貉细小病毒核酸;对照CPIV、CCV、ICHV、CAV-2疫苗毒核酸未能扩增出任何条带;对已经用病毒分离鉴定方法确诊的5份犬瘟热病料和8份貉细小病毒病料进行检测,结果利用试剂盒检测出3份犬瘟热病料,5份细小病毒病料;双重PCR方法全部检出。用该双重PCR方法对55份临床样品进行检测,检出貉犬瘟热7份,貉细小病毒14份,混合感染的4份。从大庆地区分离到一株貉源犬瘟热病毒,命名为CDV–DQ株。从大庆地区分离到八株貉源细小病毒,经鉴定为CPV-2c型,命名为:RDPV-DQ01~RDPV-DQ08。建立了检测貉犬瘟热病毒和貉细小病毒的双重PCR方法。该方法快速、敏感、特异可以用于临床样品的检测。

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学(兽医学) > 兽医基础科学 > 家畜微生物学(兽医病原微生物学) > 家畜病毒学
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