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流感病毒核蛋白NP激活p53生物学意义及p53抗流感病毒机制解析

作　者: 晏文君
导　师: 马志永
学　校: 中国农业科学院
专　业: 预防兽医学
关键词: 流感病毒 p53 机体免疫 NP 细胞周期
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


流感病毒(Influenza A viruses, IAV)属于正粘病毒科，单股负链分节段的RNA病毒，基因组由8个RNA片段组成。人类历史上几次流感大流行都给社会带了严重的经济损失并造成了大量人群的死亡。由于病毒变异快，这给病毒的防治带来了相当大的困难。病毒感染细胞通过一系列的机制来限制病毒的复制，现阶段发现的抗流感病毒机制主要有激活趋化因子、炎性因子和抗病毒细胞因子类等。肿瘤抑制因子p53是在细胞受到各种刺激，如细胞分化、细胞衰老、DNA损伤、缺氧等，均能被激活而发挥其功能，总得来说p53作为转录调控因子，通过磷酸化和去磷酸化而在DNA损伤修复、细胞周期捕获、细胞凋亡中起到重要作用，但近年来发现p53在抗病毒免疫中也发挥着重要作用，而且有研究表明p53在细胞水平具有抗IAV作用。为了进一步研究IAV与p53之间的关系及p53在抗IAV中的作用，我们进行了如下研究：1、IAV NP蛋白激活p53生物学意义。我们通过p53-Luciferase实验发现，NP蛋白能够激活p53转录活性，通过IFA发现NP蛋白和p53蛋白之间在细胞内存在很好的共定位，通过Co-ip及BIFC实验表明NP和p53蛋白之间存在直接的相互作用。接着通过FCM检测细胞凋亡发现NP蛋白并不能引起p53依赖的细胞凋亡，但能引起细胞周期停滞于G0/G1期。这部分研究表明，IAV NP蛋白能激活p53，从而引起细胞停滞，这可能是p53抗流感病毒的一种可能机制。2、p53与流感病毒致病性之间的关系。主要是通过流感病毒PR8毒株感染p53wt(p53+/+)、p53ko(p53-/-)小鼠，分析p53wt和p53ko小鼠的发病情况、病料中病毒复制情况。发现流感病毒感染后p53ko小鼠死亡率和体重减轻都明显高于p53wt小鼠，这表明p53分子具有保护机体免受流感病毒致病性的影响。进一步分析小鼠肺脏眼观病理变化及病理切片分析表明p53ko小鼠肺组织病理损伤明显高于p53wt小鼠，而且其细胞损伤程度和炎症反应也明显强于p53wt小鼠。此外，对肺脏中病毒滴度检测表明p53ko小鼠病毒滴度明显高于p53wt小鼠，这说明，p53在机体水平具有抗流感病毒作用。以上结果说明了p53具有保护机体抗流感病毒的作用。3、小鼠淋巴细胞增殖情况分析。IAV感染p53wt、p53ko小鼠后第3天，对脾脏中CD4和CD8细胞增殖情况通过流式细胞技术检测发现，p53wt小鼠脾脏中CD4和CD8细胞在病毒感染后明显增多，但p53ko小鼠却几乎没有变化。这表明p53ko小鼠CD4和CD8细胞在IAV感染后增殖受到抑制，说明p53在淋巴细胞的增殖中起到重要作用。4、小鼠全基因组表达差异分析。通过基因芯片技术对IAV感染后第3天和第6天，p53wt、p53ko小鼠肺脏全基因表达谱进行分析，发现先天性免疫中有许多基因表达发生的明显变化，比如，病毒感染后第3天TLR信号通路中TLR8、Rac1、AKT、JNK、p38、IFN-α、AP-1、CD40、IRF7等基因表达上调；TLR4、CASP8、TNF-α、IL-1β、IL-12、CD80、CD86、NF-κB等表达下调；第6天TLR1、TLR2、TLR6、TLR7、P13K、P38、IFR7、IL-12、IFN-α、IP-10等基因表达上调；TLR9、CD80等基因表达下调。这表明p53可能在调控先天性免疫抗流感病毒过程中起着重要作用。此外对于细胞凋亡通路基因表达变化分析也发现了一些表达有明显差异的基因。而且通过本研究我们还找到了一些p53的可能靶基因及一些在抗流感病毒中可能起作用的基因，这些都有待于进一步研究。综上所述，本研究通过多个方面研究了IAV与p53之间的关系，分析了p53对IAV增殖和致病性的影响，发现了p53抗流感病毒的一些可能机制，以及一些可能参与作用的分子及细胞。进一步确立了p53在抗病毒中的作用，为以后进一步研究p53抗IAV的分子机制和抗病毒药物的研发提供了基础数据。

全文目录


摘要  6-8
Abstract  8-16
第一章 文献综述  16-30
  1.1 流感病毒概述  16-23
    1.1.1 病毒简介  16
    1.1.2 病毒结构及复制  16-19
    1.1.3 病理变化  19
    1.1.4 病毒致病机制  19-20
    1.1.5 流感病毒与机体免疫  20-22
    1.1.6 病毒 NP 蛋白结构和功能  22-23
  1.2 p53 蛋白研究概况  23-28
    1.2.1 p53 及其结构  23-24
    1.2.2 p53 与细胞凋亡  24
    1.2.3 p53 与细胞周期  24-25
    1.2.4 p53 的作用机制  25-26
    1.2.5 p53 与机体免疫  26-27
    1.2.6 p53 与炎症反应  27-28
  1.3 p53 蛋白抗病毒研究进展  28-30
    1.3.1 p53 抗病毒作用的确立  28-29
    1.3.2 p53 与流感病毒关系  29-30
第二章 流感病毒 NP 蛋白激活 p53 生物学意义  30-44
  2.1 材料  30-31
    2.1.1 质粒、菌株、毒株和细胞株  30
    2.1.2 主要试剂  30-31
  2.2 方法  31-34
    2.2.1 p53 荧光素酶活性检测  31
    2.2.2 间接免疫荧光实验  31-32
    2.2.3 双荧光分子互补实验(BIFC)质粒构建  32
    2.2.4 Western-blot  32-33
    2.2.5 免疫共沉淀(Co-ip)  33-34
    2.2.6 双分子荧光互补实验(BIFC)  34
    2.2.7 TUNEL 法检测细胞凋亡  34
    2.2.8 Annexin V 试剂盒检测细胞凋亡  34
    2.2.9 PI 法检测细胞周期  34
  2.3 实验结果及分析  34-43
    2.3.1 NP 激活 p53 转录活性  34-35
    2.3.2 NP 和 p53 在细胞内定位分析  35-36
    2.3.3 CO-ip 检测 NP 蛋白和 p53 相互作用  36-37
    2.3.4 BIFC 检测 NP 和 p53 相互作用  37-40
    2.3.5 NP 对 p53 及下游常见靶基因蛋白表达水平的影响  40
    2.3.6 TUNEL 检测细胞凋亡情况  40-41
    2.3.7 FCM 检测 NP 与细胞凋亡  41-42
    2.3.8 NP 与细胞周期变化分析  42-43
  2.4 讨论  43-44
第三章 p53 在流感病毒致病性中的作用  44-57
  3.1 材料  45-46
    3.1.1 病毒及实验动物  45-46
    3.1.2 主要试剂  46
  3.2 方法  46-50
    3.2.1 小鼠 p53 基因型检测  46
    3.2.2 IAV 病毒滴度测定  46-47
    3.2.3 IAV 对 p53 KO 小鼠致病性实验  47-48
    3.2.4 IAV 在小鼠体内复制水平检测  48
    3.2.5 小鼠肺组织病理变化观察及病理组织切片制备  48-49
    3.2.6 Western-blot 筛选检测流感病毒蛋白抗体  49
    3.2.7 免疫组化切片制备  49-50
    3.2.8 小鼠脾细胞采集及免疫细胞分型检测  50
  3.3 结果  50-56
    3.3.1 小鼠 p53 基因型检测及分析  50-51
    3.3.2 病毒滴度测定结果  51
    3.3.3 IAV 对 p53KO 小鼠致死率增加  51-52
    3.3.4 p53 抑制 IAV 在小鼠体内的复制  52-53
    3.3.5 IAV 感染 p53KO 小鼠引起更严重的病理变化  53-54
    3.3.6 检测 IAV 抗体的筛选  54-55
    3.3.7 IAV 在肺组织中的分布  55
    3.3.8 IAV 感染 p53KO 小鼠对体内免疫细胞增殖的影响  55-56
  3.4 讨论  56-57
第四章 IAV 感染小鼠肺组织的全基因表达谱差异分析  57-72
  4.1 材料  57
    4.1.1 毒株及实验动物  57
    4.1.2 实验试剂  57
  4.2 方法  57-59
    4.2.1 小鼠肺组织全基因组表达谱分析  57-58
    4.2.2 定量 real-time PCR  58
    4.2.3 p53 靶基因预测及筛选  58-59
  4.3 结果  59-71
    4.3.1 小鼠全基因组表达谱差异基因分析  59-60
    4.3.2 IAV 感染 p53WT 小鼠差异表达基因分析  60-61
    4.3.3 IAV 感染 p53WT 和 p53KO 小鼠差异表达基因分析  61-65
    4.3.4 IAV 感染 p53WT 和 p53KO 小鼠 TLRs 信号通路差异基因变化分析  65-71
  4.4 讨论  71-72
第五章 全文总结  72-73
参考文献  73-80
致谢  80-81
作者简历  81

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