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家兔MITF基因同源性、多态性分析及不同时期表达水平研究

作　者: 何孟颉
导　师: 吴信生
学　校: 扬州大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 家兔毛色小眼畸形相关转录因子(MITF) 多态性 PCR-SSCP 荧光定量PCR
分类号: S829.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

本试验克隆了家兔MITF基因第2、4、5、7外显子序列,并将其进行了与人、马、牛、大鼠、鸡等几个物种的序列同源性比较。结果发现这些外显子片段在不同的哺乳动物中都具有很高的同源性,均在90%以上,而与禽类的同源性较低,只有84%以上,说明该基因在物种进化过程中相对比较保守。本试验采用PCR-SSCP技术,以白色獭兔、海狸色獭兔、九疑山兔、比利时兔和闽西南黑兔群体为试验对象,设计引物检测家兔MITF基因中包含五个外显子的相关基因序列多态性,结果发现,引物1、2、5、7对应的扩增片段均未表现出多态,在使用引物4获得大小为255bp的扩增片段中发现一个SNP (C43T)位点,在各群体中表现为3种基因型AA、BB、AB。测序结果显示引物4扩增片段的碱基转换位于5’端的内含子区域,未证实会影响MITF基因编码的氨基酸序列。统计结果表明,白色獭兔群体和九疑山兔群体不处在哈代温伯格平衡状态(P<0.05),其余群体则均处于平衡状态。闽西南黑兔群体和比利时兔群体表现出中度多态(0.5>PIC>0.25),其余群体为低度多态。在家兔MITF基因表达规律的研究中,以福建黄兔和新西兰白兔的杂交后代群体为研究对象,分别采集生长发育阶段中第4、6、8、10、12周龄的背部皮肤样品,通过实时荧光定量PCR技术,测定各个时期的MITF基因的mRNA相对表达量,分析MITF基因在家兔这一生长发育阶段中的mRNA表达规律。结果表明,从4周龄开始,公、母兔的mRNA表达量都出现迅速增长,在6周龄达到一个峰值,随后开始下降,反映出这一段时期内,随着进入明显的换毛期,该基因也处于活跃状态。8周龄后,公、母兔开始表现不同的变化趋势,母兔进入第二个波动期,而公兔则平稳增长,结合性别间的生理变化原因,可能是由于雌激素水平的不同,引起变化趋势的差异。不同周龄的表达量变化趋势反映MITF基因在被毛的更换过程中,可能会受到毛囊生长周期及雌激素水平的影响,在一定程度上参与毛色的形成和变化的调节,是影响毛色的一个重要基因。此外,在分析正常色与黑斑皮肤的表达量差异的试验中发现,黑斑皮肤中MITF基因的表达量显著高于正常色皮肤,也验证了黑色素的形成和积累可能与MITF基因的表达有关,进而影响皮肤和被毛的颜色。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-10
常用词语缩写  10-12
第一章前言综述  12-26
  1.1 影响哺乳动物毛色的基因  12-19
    1.1.1 黑色素皮质素受体1基因(MC1R)  14
    1.1.2 鼠灰色基因(Agouti)  14-15
    1.1.3 酪氨酸酶基因(TYR)  15-16
    1.1.4 酪氨酸酶相关蛋白基因(TYRP1、TYRP2)  16-17
    1.1.5 银灰色基因(Silv)  17
    1.1.6 Kit基因  17
    1.1.7 小眼畸形相关转录因子基因(MITF)  17-19
  1.2 PCR-SSCP技术  19-21
  1.3 荧光定量PCR技术  21-24
    1.3.1 荧光标记方法  21-22
    1.3.2 荧光定量方法的选择  22-23
    1.3.3 内参基因的选择  23
    1.3.4 荧光定量试验的优化  23-24
  1.4 研究目的及意义  24-26
第二章 MITF基因部分CDS序列同源性比对  26-35
  2.1 材料与方法  26-29
    2.1.1 试验样本  26
    2.1.2 主要试剂  26
    2.1.3 主要溶液  26-27
    2.1.4 主要仪器  27
    2.1.5 家兔基因组DNA提取  27-28
    2.1.6 引物设计  28
    2.1.7 PCR扩增体系  28
    2.1.8 PCR产物回收  28-29
    2.1.9 克隆测序与结果处理  29
  2.2 结果分析  29-32
    2.2.1 PCR扩增结果  29-30
    2.2.2 序列比对分析  30-32
  2.3 讨论  32-35
第三章 MITF基因多态性分析  35-42
  3.1 材料与方法  35-37
    3.1.1 试验动物  35
    3.1.2 主要试剂与仪器  35
    3.1.3 主要溶液  35-36
    3.1.4 主要仪器  36
    3.1.5 家兔基因组DNA提取  36
    3.1.6 引物设计  36
    3.1.7 PCR扩增体系  36
    3.1.8 PCR-SSCP检测  36
    3.1.9 测序  36
    3.1.10 数据处理  36-37
  3.2 结果与分析  37-40
    3.2.1 引物PCR扩增产物检测  37-38
    3.2.2 PCR-SSCP结果  38-39
    3.2.3 PCR-SSCP测序结果  39
    3.2.4 不同家兔群体引物4扩增片段突变位点的遗传特性  39-40
  3.3 讨论  40-42
第四章 MITF基因不同发育阶段表达规律的分析  42-55
  4.1 材料与方法  42-46
    4.1.1 试验兔  42
    4.1.2 主要试剂和溶液配制  42-43
    4.1.3 仪器设备  43
    4.1.4 RNA的提取  43
    4.1.5 RNA质量和浓度测定  43
    4.1.6 RNA反转录体系  43-44
    4.1.7 荧光定量引物设计  44
    4.1.8 实时荧光定量PCR  44-45
    4.1.9 数据处理与统计分析  45-46
  4.2 结果与分析  46-52
    4.2.1 总RNA的纯度检测  46
    4.2.2 引物特异性检测  46-47
    4.2.3 溶解曲线  47-48
    4.2.4 扩增曲线  48-49
    4.2.5 MITF基因的表达规律  49-52
  4.3 讨论  52-55
第五章结论  55-56
  5.1 主要结论  55
  5.2 进一步的工作  55-56
参考文献  56-64
致谢  64-65
攻读学位期间发表和参与发表的学术论文目录  65-66

家兔MITF基因同源性、多态性分析及不同时期表达水平研究

内容摘要

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